酯酶結(jié)合熒光分析法可對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè),某研究院利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一種催化效率高、農(nóng)藥敏感性強(qiáng)的微生物酯酶。
限制酶 |
識(shí)別序列與切割位點(diǎn) |
限制酶 |
識(shí)別序列與切割位點(diǎn) |
PstⅠ |
5'-CTGCA↓G-3' |
NdeⅡ |
5'-↓GATC-3' |
HindⅢ |
5'-A↓AGCTT-3' |
EcoRⅠ |
5'-G↓AATTC-3' |
DpnⅡ |
5'-↓GATC-3' |
AluⅠ |
5'-AG↓CT-3' |
(1)人工合成酯酶基因后通過(guò)PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增,為該過(guò)程提供能量的是
4種dNTP
4種dNTP
;還需要設(shè)計(jì)兩種引物,設(shè)計(jì)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的
3’端
3’端
開(kāi)始連接脫氧核苷酸。為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒,需要在引物的5'端設(shè)計(jì)
HindⅢ、EcoR I
HindⅢ、EcoR I
酶的識(shí)別序列。某質(zhì)粒圖譜和目的基因的序列如圖所示,應(yīng)選擇引物
①③
①③
(填數(shù)字,①-④中加粗表示識(shí)別序列前的保護(hù)堿基,增強(qiáng)上述酶與目的基因的結(jié)合)
①5'-
CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3'
②5'-
CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3'
③5'-
CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3'
④5'-
CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3'
(2)若提取高產(chǎn)酯酶野生菌的基因組DNA,用設(shè)計(jì)的引物和合適的條件進(jìn)行PCR,其產(chǎn)物可用
(瓊脂糖凝膠)電泳
(瓊脂糖凝膠)電泳
鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜帶存在,分析可能原因是:
在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點(diǎn)/引物特異性不強(qiáng)/引物過(guò)短
在基因組DNA中有其他引物結(jié)合的位點(diǎn)/引物特異性不強(qiáng)/引物過(guò)短
。解決措施:在目的基因的
上、下游
上、下游
(填“內(nèi)部”或“上、下游”)重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。
(3)將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒用限制酶酶切,酶切產(chǎn)物純化后,用
DNA連接酶
DNA連接酶
連接,連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌前需處理大腸桿菌,使其處于
感受態(tài)
感受態(tài)
。
(4)將目的蛋白與某些標(biāo)簽融合表達(dá)形成含標(biāo)簽的融合蛋白,實(shí)現(xiàn)增溶、防降解、促進(jìn)分泌、便于純化和檢測(cè)等功能。6×his——Tag(組氨酸標(biāo)簽)含有的咪唑基團(tuán)選擇性地結(jié)合在已固定于層析介質(zhì)的Ni
2+、Co
2+等金屬離子上。高濃度的咪唑緩沖液可以競(jìng)爭(zhēng)性洗脫結(jié)合在介質(zhì)上的His標(biāo)簽蛋白。據(jù)此推測(cè)6×his——Tag的作用之一是
便于純化目的蛋白
便于純化目的蛋白
。