24.酯酶結合熒光分析法可對有機磷和氨基甲酸酯類農藥進行檢測,某研究院利用轉基因技術獲得一種催化效率高、農藥敏感性強的微生物酯酶。
限制酶 |
識別序列與切割位點 |
限制酶 |
識別序列與切割位點 |
PstⅠ |
5'-CTGCA↓G-3' |
NdeⅡ |
5'-↓GATC-3' |
HindⅢ |
5'-A↓AGCTT-3' |
EcoRⅠ |
5'-G↓AATTC-3' |
DpnⅡ |
5'-↓GATC-3' |
AluⅠ |
5'-AG↓CT-3' |
(1)人工合成酯酶基因后通過PCR技術可實現(xiàn)擴增,為該過程提供能量的是
;還需要設計兩種引物,設計引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的
開始連接脫氧核苷酸。為方便構建重組質粒,需要在引物的5'端設計
酶的識別序列。某質粒圖譜和目的基因的序列如圖所示,應選擇引物
(填數(shù)字,①-④中加粗表示識別序列前的保護堿基,增強上述酶與目的基因的結合)
①5'-
CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3'
②5'-
CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3'
③5'-
CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3'
④5'-
CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3'
(2)若提取高產(chǎn)酯酶野生菌的基因組DNA,用設計的引物和合適的條件進行PCR,其產(chǎn)物可用
鑒定。結果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜帶存在,分析可能原因是:
。解決措施:在目的基因的
(填“內部”或“上、下游”)重新設計引物進行PCR。
(3)將PCR產(chǎn)物和質粒用限制酶酶切,酶切產(chǎn)物純化后,用
連接,連接產(chǎn)物導入大腸桿菌前需處理大腸桿菌,使其處于
。
(4)將目的蛋白與某些標簽融合表達形成含標簽的融合蛋白,實現(xiàn)增溶、防降解、促進分泌、便于純化和檢測等功能。6×his——Tag(組氨酸標簽)含有的咪唑基團選擇性地結合在已固定于層析介質的Ni
2+、Co
2+等金屬離子上。高濃度的咪唑緩沖液可以競爭性洗脫結合在介質上的His標簽蛋白。據(jù)此推測6×his——Tag的作用之一是
。