腦心肌炎病毒（EMCV，RNA病毒）是引起人、豬腦炎和心肌炎的病原體。為研制疫苗，科研人員按如圖流程培育轉(zhuǎn)基因酵母菌，來(lái)生產(chǎn)EMCV的衣殼蛋白VP1。其中，受體酵母菌是組氨酸合成缺陷型，HIS4基因表達(dá)的酶催化組氨酸的合成，C418是一種抗生素。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
| 限制酶 |
EcoRⅠ |
NotⅠ |
SalⅠ |
| 識(shí)別序列和切割位點(diǎn) |
G↓AATTC |
GC↓GGCCGC |
G↓TCGAC |
（1）過(guò)程①通過(guò)RT?PCR獲得目的基因，下列3種引物中，過(guò)程①應(yīng)選擇的是
a、c
a、c
。
a.5′?GGAATTCGCCACCATGGGAGTGGAAAACGCTGAA?3′
b.5′?TCGTCGACCATCGATAGCCACTGGCCTAACGCC?3′
c.5′?ATTTGCGGCCGCTCACTCTAGCATCAAGACT?3′
（2）PCR技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，可用于擴(kuò)增目的基因，制作探針，引入定點(diǎn)突變，定量檢測(cè)DNA等。完成下列有關(guān)PCR技術(shù)和相關(guān)應(yīng)用的問(wèn)題：
①PCR過(guò)程中，溫度的控制至關(guān)重要，變性溫度過(guò)低會(huì)因?yàn)?
DNA雙鏈不能充分解開(kāi)，導(dǎo)致模板減少
DNA雙鏈不能充分解開(kāi)，導(dǎo)致模板減少
，最終都會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)效率降低。退火溫度過(guò)高則會(huì)因
引物不能與模板充分配對(duì)
引物不能與模板充分配對(duì)
導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的量減少。
②不對(duì)稱(chēng)PCR是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別為限制性引物與非限制性引物，其最佳比例一般為1：50～1：100，在PCR反應(yīng)的最初10～15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物最初主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物消耗完后，非限制性引物引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。假設(shè)反應(yīng)體系中原來(lái)有a個(gè)模板DNA，最初10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA，后20個(gè)循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈，則需要限制性引物
（211?2）a÷2
（211?2）a÷2
個(gè)。因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的
相對(duì)分子質(zhì)量（堿基數(shù)量）不同
相對(duì)分子質(zhì)量（堿基數(shù)量）不同
不同，可通過(guò)
電泳法
電泳法
將其分離。
（3）過(guò)程③將質(zhì)粒2導(dǎo)入大腸桿菌的目的是
讓其在大腸桿菌中復(fù)制
讓其在大腸桿菌中復(fù)制
。
（4）過(guò)程⑤將質(zhì)粒2線性化時(shí)使用的是
限制酶SalⅠ
限制酶SalⅠ
（限制酶），過(guò)程⑥線性DNA需整合到酵母細(xì)胞的染色體DNA中目的基因才能
穩(wěn)定遺傳并表達(dá)
穩(wěn)定遺傳并表達(dá)
。
（5）線性DNA整合到酵母細(xì)胞染色體DNA時(shí)，可能是單拷貝整合，也可能是多拷貝整合。過(guò)程⑦先將酵母菌培養(yǎng)在缺乏
組氨酸
組氨酸
的培養(yǎng)基中，篩選獲得導(dǎo)入目的基因的酵母菌；后將篩選出的酵母菌接種于含2mg?L
-1G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)良好的酵母菌再轉(zhuǎn)接到含4mg?L
-1G418的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，其目的是
篩選出目的基因多拷貝整合的酵母菌
篩選出目的基因多拷貝整合的酵母菌
。
（6）研究人員用兔抗EMCV血清與酵母細(xì)胞生產(chǎn)的VP1蛋白進(jìn)行抗原?抗體免疫反應(yīng)試驗(yàn)，其目的是
檢測(cè)酵母細(xì)胞生產(chǎn)的VP1與EMCV的VP1的抗原性（結(jié)構(gòu)）是否一致
檢測(cè)酵母細(xì)胞生產(chǎn)的VP1與EMCV的VP1的抗原性（結(jié)構(gòu)）是否一致
。
