In-Fusion技術(shù)是一項(xiàng)新型的無縫克隆技術(shù)。技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常為15~20bp),然后用In-Fusion酶(能識(shí)別雙鏈線性化DNA片段5'→3'末端16個(gè)堿基,并使其降解)處理即可實(shí)現(xiàn)無縫連接。如圖是將氨芐青霉素抗性基因(目的基因)與線性化質(zhì)粒無縫連接的操作步驟。回答下列問題:
(1)過程①反應(yīng)體系中,除圖中所示物質(zhì)外還需添加
Taq酶、dNTP(脫氧核苷酸)、含Mg2+的磷酸緩沖液
Taq酶、dNTP(脫氧核苷酸)、含Mg2+的磷酸緩沖液
,質(zhì)粒線性化前后所含有的游離磷酸基團(tuán)的個(gè)數(shù)分別為
0、2
0、2
個(gè)。
(2)In-Fusion酶的作用原理是:該酶識(shí)別線性化DNA片段末端,按照5'→3'方向,依次斷裂
磷酸二酯(鍵)
磷酸二酯(鍵)
鍵,最終使線性化DNA片段兩端出現(xiàn)黏性末端。為保證過程②擴(kuò)增出能與線性化質(zhì)粒連接的目的基因,設(shè)計(jì)引物A或引物B的依據(jù)是
目的基因和質(zhì)粒
目的基因和質(zhì)粒
的堿基序列,以保證擴(kuò)增出的目的基因和線性質(zhì)粒兩側(cè)含有同源序列。
(3)過程④中,用
Ca2+
Ca2+
處理大腸桿菌,以便重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。重組質(zhì)粒利用大腸桿菌細(xì)胞中的DNA聚合酶和
DNA連接酶
DNA連接酶
酶,實(shí)現(xiàn)完全環(huán)化。
(4)通過檢測(cè)大腸桿菌的致死率可反映其轉(zhuǎn)化后的抗性效果。在含
氨芐青霉素
氨芐青霉素
的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間,然后分別用顯微鏡計(jì)數(shù)法和
稀釋涂布平板
稀釋涂布平板
法進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)結(jié)果分別是M、N,則致死率可用
×100%表示。此結(jié)果較真實(shí)值偏大,原因是后一種計(jì)數(shù)時(shí)
兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起時(shí)只能觀察到一個(gè)菌落,使N的統(tǒng)計(jì)值偏小
兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起時(shí)只能觀察到一個(gè)菌落,使N的統(tǒng)計(jì)值偏小
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(5)與傳統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法相比,In-Fusion技術(shù)的優(yōu)勢(shì)之一是
不受限制酶切位點(diǎn)的限制;可以把目的基因插入任何位點(diǎn);避免限制酶切割對(duì)質(zhì)粒功能區(qū)的破壞
不受限制酶切位點(diǎn)的限制;可以把目的基因插入任何位點(diǎn);避免限制酶切割對(duì)質(zhì)粒功能區(qū)的破壞
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