22.In-Fusion技術(shù)是一項新型的無縫克隆技術(shù)。技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常為15~20bp),然后用In-Fusion酶(能識別雙鏈線性化DNA片段5'→3'末端16個堿基,并使其降解)處理即可實現(xiàn)無縫連接。如圖是將氨芐青霉素抗性基因(目的基因)與線性化質(zhì)粒無縫連接的操作步驟?;卮鹣铝袉栴}:
(1)過程①反應(yīng)體系中,除圖中所示物質(zhì)外還需添加
,質(zhì)粒線性化前后所含有的游離磷酸基團的個數(shù)分別為
個。
(2)In-Fusion酶的作用原理是:該酶識別線性化DNA片段末端,按照5'→3'方向,依次斷裂
鍵,最終使線性化DNA片段兩端出現(xiàn)黏性末端。為保證過程②擴增出能與線性化質(zhì)粒連接的目的基因,設(shè)計引物A或引物B的依據(jù)是
的堿基序列,以保證擴增出的目的基因和線性質(zhì)粒兩側(cè)含有同源序列。
(3)過程④中,用
處理大腸桿菌,以便重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞。重組質(zhì)粒利用大腸桿菌細胞中的DNA聚合酶和
酶,實現(xiàn)完全環(huán)化。
(4)通過檢測大腸桿菌的致死率可反映其轉(zhuǎn)化后的抗性效果。在含
的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間,然后分別用顯微鏡計數(shù)法和
法進行計數(shù),計數(shù)結(jié)果分別是M、N,則致死率可用
×100%表示。此結(jié)果較真實值偏大,原因是后一種計數(shù)時
。
(5)與傳統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法相比,In-Fusion技術(shù)的優(yōu)勢之一是
。