糖化酶是將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶,大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人員將經(jīng)誘變處理后獲取的黑曲霉菌高產(chǎn)糖化酶基因?qū)氘叧嘟湍窯S115(對(duì)氨芐青霉素不敏感)中,構(gòu)建能直接利用淀粉的工程菌,該過(guò)程所用質(zhì)粒(僅示部分結(jié)構(gòu))如圖1所示。質(zhì)粒的外側(cè)鏈為a鏈,內(nèi)側(cè)鏈為b鏈。基因Ampr轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于b鏈的片段。三種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)下表。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
(1)為獲得糖化酶高產(chǎn)菌株,研究人員將經(jīng)誘變處理后的黑曲霉菌接種到
淀粉
淀粉
含量高的培養(yǎng)基上,恒溫培養(yǎng)適宜時(shí)間后滴加碘液,挑選出透明圈(不產(chǎn)生藍(lán)色)直徑 較大
較大
(填“較大”或“較小”)的菌株。再進(jìn)行復(fù)篩以及穩(wěn)定性遺傳實(shí)驗(yàn)。
(2)質(zhì)粒復(fù)制的模板鏈?zhǔn)?a和b
a和b
(選填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”)鏈。高產(chǎn)糖化酶基因插入質(zhì)粒后,其轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于 a
a
鏈的片段。
限制酶 |
BamHⅠ |
PstⅠ |
XbaⅠ |
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)(5'→3') |
G↓GATCC |
C↓TGCAG |
T↓CTAGA |
|
相關(guān)結(jié)構(gòu): PAOXI:甲醇誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子 TAOXI:終止子 HIS4:組氨酸脫氫酶基因,其表達(dá)產(chǎn)物催化組氨酸合成 Orl:復(fù)制原點(diǎn) Ampr:氨芐青霉素抗性基因 |
(3)構(gòu)建高產(chǎn)糖化酶基因表達(dá)載體時(shí),用限制酶切割質(zhì)粒pPIC9K,圖2是高產(chǎn)糖化酶基因示意圖(僅示部分堿基),為使其能定向插入表達(dá)載體并成功表達(dá),引物應(yīng)包含
BamHI和XbaI
BamHI和XbaI
(BamHⅠ/PstⅠ/XbaⅠ)酶識(shí)別序列,則PCR擴(kuò)增時(shí)引物的減基序列為
①④
①④
。(多選)
①5'-TCTAGATCTGTTGAAT-3'②5'-TCTAGAAGACAACTTA-3'
③5'-CTGCAGCTTGGATGAT-3'④5'-GGATCCCTTGGATGAT-3'
⑤5'-GGATCCGAACCTACTA-3'⑥5'-CTCGAGTCTGTTGAAT-3'