細(xì)胞核定位信號(hào)(NLS)能夠促進(jìn)蛋白定位于細(xì)胞核中,科研人員通過基因工程技術(shù),將NLS基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合,插入植物雙元表達(dá)載體pRI101中,獲得一個(gè)新的pRI101-NLS-GFP植物表達(dá)載體,該載體有望在病原菌蛋白細(xì)胞生物學(xué)功能研究中得到廣泛應(yīng)用。請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問題:
(1)若已知NLS基因的脫氧核苷酸序列,則可采用
人工合成
人工合成
法獲得該目的基因。該方法在獲取目的基因時(shí) 不需要
不需要
(填“需要”或“不需要”)模板。
(2)在構(gòu)建NLS-GFP融合基因時(shí),需在設(shè)計(jì)引物 5’端
5’端
時(shí)添加同源序列。將添加同源序列的GFP與NLS融合,用特定的DNA酶處理,形成黏性末端,然后降溫以促進(jìn) 黏性末端堿基配對(duì)
黏性末端堿基配對(duì)
形成NLS-GFP融合基因。
(3)為獲得融合熒光蛋白,設(shè)計(jì)P4時(shí)不能包含終止密碼子的編碼序列,否則將導(dǎo)致 綠色熒光蛋白(GFP)不含有NLS定位信號(hào)
綠色熒光蛋白(GFP)不含有NLS定位信號(hào)
。
(4)過程④在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),應(yīng)選擇 NdeⅠ、SmaⅠ
NdeⅠ、SmaⅠ
酶連接。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)需要用氯化鈣處理,其目的 使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)
使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)
。
(5)在受體細(xì)胞中,NLS被相應(yīng)蛋白質(zhì)識(shí)別后通過 核孔
核孔
進(jìn)入 細(xì)胞核
細(xì)胞核
,所以可觀察到綠色熒光主要漿集在此處。為了更具科學(xué)性,應(yīng)向?qū)φ战M的受體細(xì)胞中導(dǎo)入 不含融合基因雙元表達(dá)載體pRⅠ101
不含融合基因雙元表達(dá)載體pRⅠ101
質(zhì)粒。