人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點,該位點結(jié)合BCL11A蛋白后,γ基因的表達被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列,解除對γ基因表達的抑制,可對某種地中海貧血癥進行基因治療??蒲腥藛T擴增了γ基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。
(1)圖中啟動子是
RNA聚合酶
RNA聚合酶
識別和結(jié)合位點,且啟動子是具有方向性的,目的基因只有正確插入啟動子和終止子之間才能正確表達。在表達載體中綠色熒光蛋白基因作為 標(biāo)記基因
標(biāo)記基因
,要使其成功表達,圖b中還缺啟動子,請判斷即將插入的啟動子方向 向左
向左
(填“向左”或“向右”)。
(2)利用PCR技術(shù)擴增γ基因上游不同DNA片段的原理是 DNA雙鏈復(fù)制
DNA雙鏈復(fù)制
,為使PCR反應(yīng)體系中的模板解鏈為單鏈,需要滿足的條件是 加熱至90-95℃
加熱至90-95℃
。
(3)將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)綠色熒光蛋白基因表達,需要在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知,在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶應(yīng)為 EcoRI
EcoRI
,在F1~F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是 SalI
SalI
。
(4)從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程中,除限制酶外,還必須用到的工具酶有DNA連接酶和 耐高溫的DNA聚合酶
耐高溫的DNA聚合酶
。
(5)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細胞,成功轉(zhuǎn)化后,含F(xiàn)1~F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白,受體細胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光的原因是 F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達
F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達
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(6)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)1~F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光,而含F(xiàn)5~F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點序列,據(jù)此結(jié)果可推測,BCL11A蛋白結(jié)合位點位于 引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上
引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上
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