人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點，該位點結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療?？蒲腥藛T擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。

（1）圖中啟動子是

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識別和結(jié)合位點，且啟動子是具有方向性的，目的基因只有正確插入啟動子和終止子之間才能正確表達。在表達載體中綠色熒光蛋白基因作為

標(biāo)記基因

標(biāo)記基因

，要使其成功表達，圖b中還缺啟動子，請判斷即將插入的啟動子方向

向左

向左

（填“向左”或“向右”）。
（2）利用PCR技術(shù)擴增γ基因上游不同DNA片段的原理是

DNA雙鏈復(fù)制

DNA雙鏈復(fù)制

，為使PCR反應(yīng)體系中的模板解鏈為單鏈，需要滿足的條件是

加熱至90-95℃

加熱至90-95℃

。
（3）將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)綠色熒光蛋白基因表達，需要在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知，在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶應(yīng)為

EcoRI

EcoRI

，在F1～F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是

SalI

SalI

。
（4）從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程中，除限制酶外，還必須用到的工具酶有DNA連接酶和

耐高溫的DNA聚合酶

耐高溫的DNA聚合酶

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（5）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細胞無熒光的原因是

F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達

F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達

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（6）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點位于

引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

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