解磷菌是一種能將土壤中植物不能利用的磷轉(zhuǎn)化為植物可以利用磷的功能微生物（主要為細(xì)菌），在提高土壤中有效磷含量、促進(jìn)磷循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用。解磷菌能分解含磷化合物使得菌落周圍會出現(xiàn)透明圈。如圖1為從某植物根際土壤中篩選出高效解磷菌的部分流程示意圖，步驟Ⅰ表示將1g土壤加入到100mL滅過菌的PVK培養(yǎng)基培養(yǎng)。36h后，取10mL培養(yǎng)液接種于100mLPVK培養(yǎng)基繼續(xù)富集培養(yǎng)；連續(xù)富集培養(yǎng)3次后進(jìn)行實驗步驟Ⅱ—Ⅳ（B、C中培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分與A相同）。請據(jù)圖回答：

（1）用于培養(yǎng)解磷菌的培養(yǎng)基在接種前需要通過

高壓蒸汽滅菌

高壓蒸汽滅菌

法進(jìn)行滅菌。從成分上看，與A相比，B中多了

瓊脂

瓊脂

（填物質(zhì)名稱）。
（2）在操作Ⅱ、Ⅲ中，采用的接種方法分別是

稀釋涂布平板法

稀釋涂布平板法

、

平板劃線法

平板劃線法

。
（3）為了盡快觀察到解磷菌培養(yǎng)的實驗結(jié)果，應(yīng)將接種了樣品的平板倒置于

恒溫箱

恒溫箱

中培養(yǎng)，并同時在另一平板上接種無菌水作為對照進(jìn)行實驗。
（4）在固體培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)出解磷菌后，需通過測量

透明圈和菌落

透明圈和菌落

直徑，比較它們的比值以確定其解磷能力從而篩選出目標(biāo)菌株。
（5）分離出的解磷菌，需通過分子鑒定以確定種屬關(guān)系。常用的方法是對細(xì)菌的核糖體RNA（16SrRNA）所對應(yīng)的16SrDNA進(jìn)行序列分析（基因公司測序），在測序前一般采用菌落PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增。
①菌落PCR直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與傳統(tǒng)PCR相比省時省力，其原因是

不需要從細(xì)胞中提取目的基因或人工合成目的基因

不需要從細(xì)胞中提取目的基因或人工合成目的基因

。
②在PCR實驗中，按照圖的設(shè)計設(shè)置好PCR程序，其中a表示

預(yù)變性

預(yù)變性

，常采用

瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳

來鑒定PCR的產(chǎn)物。
③在進(jìn)行菌落PCR時，首先根據(jù)

16SrDNA

16SrDNA

兩端的脫氧核苷酸序列來設(shè)計引物。已知相關(guān)的上游引物序列為5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，則下游引物的序列最合適的是

b

b

。
a.5′-ACAATATGTATAATCT-3′
b.5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
c.5′-GCAATGCGTGCATTGC-3′
d.5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′