研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體腫瘤內(nèi)部通常是缺氧的環(huán)境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用于核糖體，使蛋白合成受阻，從而引起細(xì)胞死亡。TAT是一種短肽，可轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，含有氧依賴性降解區(qū)域ODD（多肽）的融合蛋白可以適應(yīng)低氧條件穩(wěn)定存在，但在常氧條件下會被蛋白酶降解?？蒲腥藛T以RTA作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性分子，利用TAT的作用將融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并利用ODD的作用減輕RTA對正常細(xì)胞的毒性，分別構(gòu)建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融合基因的表達(dá)載體，并成功得到相關(guān)融合蛋白。
（1）可采用PCR的方法獲取融合基因TAT-RTA，需要根據(jù)TAT和RTA基因設(shè)計引物，引物的作用是
與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對，并且使Taq酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對，并且使Taq酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
。已知RTA基因和欲得到的TAT-RTA融合基因的結(jié)構(gòu)如圖1所示，TAT基因編碼鏈序列5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，為順利構(gòu)建表達(dá)載體，需要在引物1的5′端加入 BamHⅠ
BamHⅠ
酶切位點(diǎn)，引物2的5′端加入 XboⅠ
XboⅠ
酶切位點(diǎn)，利用TAT和RTA核酸序列設(shè)計引物時，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，請根據(jù)要求寫出引物1 5′GGATCCATGAGC3′
5′GGATCCATGAGC3′
（寫出引物5′→3′端的12個堿基即可）。
（2）載體的部分結(jié)構(gòu)如圖2所示。His標(biāo)簽由連續(xù)的6個組氨酸構(gòu)成，可用于對重組融合蛋白進(jìn)行分離純化，將PCR得到的TAT-RTA融合基因和載體雙酶切后，再用 DNA連接
DNA連接
酶連接，但是在研究時，發(fā)現(xiàn)融合蛋白中沒有His標(biāo)簽蛋白，據(jù)圖分析原因是 限制酶2識別序列后面的一個堿基A與His標(biāo)簽基因編碼鏈的前兩個堿基CA編碼一個氨基酸，導(dǎo)致His標(biāo)簽基因?qū)?yīng)的mRNA的密碼子被錯位讀取
限制酶2識別序列后面的一個堿基A與His標(biāo)簽基因編碼鏈的前兩個堿基CA編碼一個氨基酸，導(dǎo)致His標(biāo)簽基因?qū)?yīng)的mRNA的密碼子被錯位讀取
，結(jié)合圖1和圖2可對引物2序列5′CTCGAGGAACTG......3′進(jìn)行 在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之間任意增加2個堿基
在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之間任意增加2個堿基
的設(shè)計可使His標(biāo)簽正常表達(dá)。
（3）科研人員將得到的重組融合蛋白經(jīng)腹腔給藥荷瘤小鼠（患實(shí)體腫瘤的小鼠稱為荷瘤小鼠），研究荷瘤小鼠腫瘤體積變化，結(jié)果如圖3所示。TAT-RTA和TAT-RTA-ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠腫瘤體積的增長，TAT-RTA-ODD
TAT-RTA-ODD
的抑制效果更好，產(chǎn)生該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是 含有氧依賴性降解區(qū)域ODD（多肽）的融合蛋白可以適應(yīng)腫瘤內(nèi)部低氧條件穩(wěn)定存在，從而更好地抑制腫瘤體積增長
含有氧依賴性降解區(qū)域ODD（多肽）的融合蛋白可以適應(yīng)腫瘤內(nèi)部低氧條件穩(wěn)定存在，從而更好地抑制腫瘤體積增長
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