目前人胰島素是通過基因工程生產(chǎn)的，其純度高、副作用少，利用大腸桿菌可實(shí)現(xiàn)人胰島素的大規(guī)模生產(chǎn)。已知限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ與MboⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)分別為-G^↓GATCC-和-^↓GATC-，圖1為目的基因與pBR322質(zhì)粒形成重組質(zhì)粒的2種情況，圖2為抗藥性篩選流程。（注：BamHⅠ、PstⅠ、MboⅠ為限制酶，ori為復(fù)制原點(diǎn)，Amp為氨芐青霉素抗性基因，Tet為四環(huán)素抗性基因。上標(biāo)“r”代表抗性；“s”代表敏感）。

（1）獲取人的胰島素基因時(shí)，先從胰島B細(xì)胞獲取胰島素基因的mRNA，再通過

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

過程獲得cDNA，此方法獲得的基因與細(xì)胞內(nèi)的胰島素基因相比在結(jié)構(gòu)上缺少

內(nèi)含子

內(nèi)含子

等序列。
（2）通過上述方法獲得人的胰島素基因后，需要通過PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。Taq Man探針是qPCR技術(shù)中一種常用探針，下圖3為Taq Man熒光探針及其作用原理示意圖。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)該探針能被Taq酶切割降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增1個(gè)DNA分子，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。若每分子探針?biāo)忉尫诺腞基團(tuán)熒光強(qiáng)度為a,加入b個(gè)模板DNA分子（目的基因），通過qPCR進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度（Rn）與擴(kuò)增次數(shù)（n）之間的關(guān)系為：Rn=

ab×（2ⁿ-1）

ab×（2ⁿ-1）

。
（3）據(jù)圖1中的信息，若胰島素基因與質(zhì)粒分別使用MboⅠ和BamHⅠ不同的限制酶切開，插在質(zhì)粒pBR322的BamHⅠ位點(diǎn)處，在形成重組質(zhì)粒之后，再重新切下目的基因最好使用

MboI

MboI

酶；用限制酶BamHⅠ處理質(zhì)粒pBR322后得到的分子中共有

2

2

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。
（4）抗藥性篩選法實(shí)施的前提條件是載體DNA攜帶抗生素的抗性基因。如果采用圖2抗藥性篩選流程，則可篩選出的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌的表現(xiàn)型是

Amp^rTet^s，即在含Amp的培養(yǎng)基上能存活，含Tet的培養(yǎng)基上死亡

Amp^rTet^s，即在含Amp的培養(yǎng)基上能存活，含Tet的培養(yǎng)基上死亡

。
（5）除抗藥性篩選法外，顯色篩選也是常用的方法。很多大腸桿菌的質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ'標(biāo)記基因（圖4中甲），其表達(dá)的酶蛋白可將一種無色的化合物（X-gal）水解成藍(lán)色產(chǎn)物。若重組DNA技術(shù)常用的大腸桿菌質(zhì)粒pUC18同時(shí)攜帶Amp^r和LacZ'兩個(gè)標(biāo)記基因，據(jù)圖4分析，若想篩選出重組質(zhì)粒，配制的固體培養(yǎng)基的成分中，除營養(yǎng)物質(zhì)和瓊脂外還需含有

Amp和X-gal

Amp和X-gal

，經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、涂布，圖4乙中含重組質(zhì)粒的是

白色

白色

（白色/藍(lán)色）菌落。
（6）某研究人員測定受體大腸桿菌的某段基因序列，經(jīng)測定其蛋白質(zhì)編碼序列（即編碼從起始密碼子到終止密碼子之間的序列）為3002對(duì)堿基，請(qǐng)判斷對(duì)這段序列的測定

是

是

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