25．PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?；卮鹣铝袉栴}：
注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中
（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)
過程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對特異性引物來擴(kuò)增目的基因。
（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，在利用PCR擴(kuò)增phb2基因時(shí)，為了使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，以便構(gòu)建基因表達(dá)載體，可以考慮在引物的
（填“3'”端或“5'端”）添加限制酶識(shí)別序列。而在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入兩種不同限制酶的識(shí)別序列是常用方法，對于酶切的phb2基因和載體來說選擇兩種限制酶切比只用一種限制酶切好的原因是：
。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用
（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
| 名稱 |
識(shí)別序列及切割位點(diǎn) |
名稱 |
識(shí)別序列及切割位點(diǎn) |
| HindⅢ |
A↓AGCTT
TTCGA↑A |
EcoRⅠ |
G↓AATTC
CTTAA↑G |
| Pvit2 |
CAG↓CTG
GTC↑GAC |
PstⅠ |
CTGC↓AG
GA↑CGTC |
| KpnⅠ |
G↓GTACC
CCATG↑G |
BamHⅠ |
G↓GATCC
CCTAG↑G |
注：箭頭表示切割位點(diǎn)
（3）將符合要求的基因表達(dá)載體導(dǎo)入工程菌后，可用
技術(shù)檢測PHB2蛋白是否合成，通過提取、分離和純化，從發(fā)酵液中獲得該蛋白。為防止PHB2蛋白在工程菌細(xì)胞中被降解，在發(fā)酵過程中應(yīng)選用
缺陷型工程菌作為受體細(xì)胞，且在發(fā)酵結(jié)束后的純化過程中應(yīng)添加蛋白酶抑制劑。
（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電分離，結(jié)果如圖2，
號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
