25.PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因,研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因),大小為0.9kb(1kb=1000堿基對),利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?;卮鹣铝袉栴}:
注:M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物;小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中
(1)為獲取phb2基因,提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA,再經(jīng)
過程得到cDNA,將其作為PCR反應(yīng)的模板,并設(shè)計(jì)一對特異性引物來擴(kuò)增目的基因。
(2)圖1為所用載體圖譜示意圖,在利用PCR擴(kuò)增phb2基因時(shí),為了使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割,以便構(gòu)建基因表達(dá)載體,可以考慮在引物的
(填“3'”端或“5'端”)添加限制酶識(shí)別序列。而在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入兩種不同限制酶的識(shí)別序列是常用方法,對于酶切的phb2基因和載體來說選擇兩種限制酶切比只用一種限制酶切好的原因是:
。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí),可選用
(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。
相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
名稱 |
識(shí)別序列及切割位點(diǎn) |
名稱 |
識(shí)別序列及切割位點(diǎn) |
HindⅢ |
A↓AGCTT TTCGA↑A |
EcoRⅠ |
G↓AATTC CTTAA↑G |
Pvit2 |
CAG↓CTG GTC↑GAC |
PstⅠ |
CTGC↓AG GA↑CGTC |
KpnⅠ |
G↓GTACC CCATG↑G |
BamHⅠ |
G↓GATCC CCTAG↑G |
注:箭頭表示切割位點(diǎn)
(3)將符合要求的基因表達(dá)載體導(dǎo)入工程菌后,可用
技術(shù)檢測PHB2蛋白是否合成,通過提取、分離和純化,從發(fā)酵液中獲得該蛋白。為防止PHB2蛋白在工程菌細(xì)胞中被降解,在發(fā)酵過程中應(yīng)選用
缺陷型工程菌作為受體細(xì)胞,且在發(fā)酵結(jié)束后的純化過程中應(yīng)添加蛋白酶抑制劑。
(4)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),隨機(jī)挑取菌落(分別編號(hào)為1、2、3、4)培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,用(2)中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)電分離,結(jié)果如圖2,
號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。