PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題：

注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中
（1）為獲取phb2基因，提取該動物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

過程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計一對特異性引物來擴增目的基因。
（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，在利用PCR擴增phb2基因時，為了使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，以便構(gòu)建基因表達載體，可以考慮在引物的

5'端

5'端

（填“3'”端或“5'端”）添加限制酶識別序列。而在擴增的phb2基因兩端分別引入兩種不同限制酶的識別序列是常用方法，對于酶切的phb2基因和載體來說選擇兩種限制酶切比只用一種限制酶切好的原因是：

可以防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，也可以防止目的基因和質(zhì)粒的反向連接

可以防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，也可以防止目的基因和質(zhì)粒的反向連接

。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用

T₄DNA連接酶

T₄DNA連接酶

（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
相關(guān)限制酶的識別序列及切割位點

名稱	識別序列及切割位點	名稱	識別序列及切割位點
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTC CTTAA↑G
Pvit2	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACC CCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭頭表示切割位點
（3）將符合要求的基因表達載體導(dǎo)入工程菌后，可用

抗原-抗體雜交

抗原-抗體雜交

技術(shù)檢測PHB2蛋白是否合成，通過提取、分離和純化，從發(fā)酵液中獲得該蛋白。為防止PHB2蛋白在工程菌細胞中被降解，在發(fā)酵過程中應(yīng)選用

蛋白酶

蛋白酶

缺陷型工程菌作為受體細胞，且在發(fā)酵結(jié)束后的純化過程中應(yīng)添加蛋白酶抑制劑。
（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，隨機挑取菌落（分別編號為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電分離，結(jié)果如圖2，

3

3

號菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。