21.某動物肝臟合成的P蛋白具有抑制癌細胞增殖的作用,為建立在大腸桿菌中高效表達的工程菌,研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了相關(guān)信息即該蛋白的基因編碼序列(簡稱P基因),大小為1.5kb,請補充完善以下實驗思路:
(1)為獲取P基因,提取該動物
(癌細胞、肝細胞)的
,再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化得到cDNA,將其作為PCR反應(yīng)的模板,并設(shè)計一對特異性引物來擴增P基因。
(2)圖甲為所選用的載體示意圖,其中限制酶的識別序列及切割位點見表。為了實現(xiàn)目的基因和運載體的
,選擇
限制酶的識別序列來切割。已知P基因序列內(nèi)部和兩端不含圖甲中限制酶的識別序列,在PCR擴增的P基因,兩種引物的
端分別引入上述兩種限制酶的識別序列。再將這兩種限制酶切割的P基因和載體進行連接時,可選用
(E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶),在目的基因和運載體片段間形成
。
表:相關(guān)限制酶的識別序列及切割位點
名稱 |
識別序列及切割位點 |
名稱 |
識別序列及切割位點 |
HindⅢ |
↓AAGCTTTTCGAA↑ |
EcoRⅠ |
↓GAATTCCTTAAG↑ |
PvitⅡ |
↓CAGCTGGTCGAC↑ |
PstⅠ |
↓CTGCAGGACGTC↑ |
KpnⅠ |
↓GGTACCCCATGG↑ |
BamHⅠ |
↓GGATCCCCTAGG↑ |
(注:箭頭表示切割位點)
?
(3)轉(zhuǎn)化前需用
處理大腸桿菌細胞,以提高轉(zhuǎn)化效率。基因工程的受體細胞若是植物細胞常采用
。
(4)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含
的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),隨機挑取菌落(分別編號為1、2、3、4)培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,用構(gòu)建基因表達載體時所選用的限制酶進行酶切,徹底酶切產(chǎn)物需通過
分離,結(jié)果如圖乙,
號菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。