22.紅景天中的HMA3基因能編碼Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白??蒲腥藛T將紅景天中的HMA3基因轉(zhuǎn)入欒樹,以實(shí)現(xiàn)欒樹的定向改良,使其增強(qiáng)對(duì)Cd的富集能力,從而更有效治理Cd污染。實(shí)驗(yàn)的主要流程如圖,其中Hyg
r為潮霉素抗性基因,Kan
r為卡拉霉素抗性基因。下表為限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問題。
EcoRⅠ |
BamHⅠ |
HindⅢ |
Sau3AⅠ |
BglⅡ |
XbaⅠ |
G↓AATTC |
G↓GATCC |
A↓AGCTT |
↓GATC |
A↓GATCT |
T↓CTAGA |
(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增、保存:
①從紅景天細(xì)胞中提取總RNA為模板,進(jìn)行RT-PCR,該過程需要加入的酶有
。PCR過程中在循環(huán)前常要進(jìn)行一次94℃、5min預(yù)變性,其目的是
。
②據(jù)以上圖表分析,為構(gòu)建Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)的融合蛋白,進(jìn)行PCR擴(kuò)增HMA3基因時(shí)需要在引物的5′端添加限制酶
的識(shí)別序列,以確保目的基因與質(zhì)粒正確連接。至少需要
個(gè)循環(huán)才能獲得預(yù)期的基因。若模板HMA3基因的數(shù)量為a個(gè),進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后,產(chǎn)物中同時(shí)含有兩種引物的DNA有
個(gè)。
③通過DNA連接酶進(jìn)行連接制備重組質(zhì)粒,并依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌。其中將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌的主要目的是
(2)欒樹愈傷組織的誘導(dǎo):
切割無菌苗將其莖段插入愈傷組織培養(yǎng)基,培養(yǎng)基應(yīng)添加
(填植物激素的名稱),放入培養(yǎng)箱,經(jīng)過21d的黑暗誘導(dǎo),形成愈傷組織。
(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的建立:
將農(nóng)桿菌單克隆菌株對(duì)欒樹愈傷組織進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化,并用添加
的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織,將愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)成完整植株。
(4)原生質(zhì)體制備及目的基因的檢測(cè)和鑒定:
①取4g篩選后愈傷組織,用鑷子輕輕搗碎,沖洗。用濾網(wǎng)過濾溶液,將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含
的酶解液中處理一段時(shí)間獲得原生質(zhì)體。
②在激光共聚焦下觀測(cè)到細(xì)胞膜發(fā)出綠色熒光。在本研究中選擇GFP與Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建融合蛋白的目的是
??茖W(xué)家們已通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造出了藍(lán)色熒光蛋白,正確的順序是
(用下列序號(hào)表示)。
①推測(cè)藍(lán)色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②藍(lán)色熒光蛋白的功能分析和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
③藍(lán)色熒光蛋白基因的修飾(合成)
④表達(dá)出藍(lán)色熒光蛋白