紅景天中的HMA3基因能編碼Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。科研人員將紅景天中的HMA3基因轉(zhuǎn)入欒樹，以實(shí)現(xiàn)欒樹的定向改良，使其增強(qiáng)對(duì)Cd的富集能力，從而更有效治理Cd污染。實(shí)驗(yàn)的主要流程如圖，其中Hyg^r為潮霉素抗性基因，Kan^r為卡拉霉素抗性基因。下表為限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問題。

EcoRⅠ	BamHⅠ	HindⅢ	Sau3AⅠ	BglⅡ	XbaⅠ
G↓AATTC	G↓GATCC	A↓AGCTT	↓GATC	A↓GATCT	T↓CTAGA

（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增、保存：
①?gòu)募t景天細(xì)胞中提取總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，該過程需要加入的酶有 。PCR過程中在循環(huán)前常要進(jìn)行一次94℃、5min預(yù)變性，其目的是 。
②據(jù)以上圖表分析，為構(gòu)建Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的融合蛋白，進(jìn)行PCR擴(kuò)增HMA3基因時(shí)需要在引物的5′端添加限制酶 的識(shí)別序列，以確保目的基因與質(zhì)粒正確連接。至少需要 個(gè)循環(huán)才能獲得預(yù)期的基因。若模板HMA3基因的數(shù)量為a個(gè)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物中同時(shí)含有兩種引物的DNA有 個(gè)。
③通過DNA連接酶進(jìn)行連接制備重組質(zhì)粒，并依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌。其中將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌的主要目的是
（2）欒樹愈傷組織的誘導(dǎo)：
切割無菌苗將其莖段插入愈傷組織培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)添加 （填植物激素的名稱），放入培養(yǎng)箱，經(jīng)過21d的黑暗誘導(dǎo)，形成愈傷組織。
（3）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的建立：
將農(nóng)桿菌單克隆菌株對(duì)欒樹愈傷組織進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，并用添加 的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織，將愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)成完整植株。
（4）原生質(zhì)體制備及目的基因的檢測(cè)和鑒定：
①取4g篩選后愈傷組織，用鑷子輕輕搗碎，沖洗。用濾網(wǎng)過濾溶液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含 的酶解液中處理一段時(shí)間獲得原生質(zhì)體。
②在激光共聚焦下觀測(cè)到細(xì)胞膜發(fā)出綠色熒光。在本研究中選擇GFP與Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建融合蛋白的目的是 。科學(xué)家們已通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造出了藍(lán)色熒光蛋白，正確的順序是 （用下列序號(hào)表示）。
①推測(cè)藍(lán)色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②藍(lán)色熒光蛋白的功能分析和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
③藍(lán)色熒光蛋白基因的修飾（合成）
④表達(dá)出藍(lán)色熒光蛋白

【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．

【答案】耐高溫的DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；增加模板DNA徹底變性的概率（使模板DNA充分變性）；BglⅡ和HindⅢ；3；（2³⁵-2）a；讓其在大腸桿菌中復(fù)制、保存；細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素；潮霉素；纖維素酶和果膠酶；通過觀察綠色熒光來確定Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否表達(dá)以及分布場(chǎng)所；②①③④