25.真菌AFPs基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能提高細(xì)胞的抗凍能力,將AFPs基因?qū)敕阎信嘤箖龇哑贩N,能延長番茄果實的儲存期??蒲腥藛T通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出超量表達(dá)AFPs基因的轉(zhuǎn)基因番茄。在超量表達(dá)AFPs基因載體的構(gòu)建中,含AFPs基因的DNA片段以及基因表達(dá)載體的元件組成情況如圖所示,其中強(qiáng)啟動子能驅(qū)動基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄,M基因會影響AFPs基因的表達(dá)效果。
?
(1)利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增可得到大量的AFPs基因,PCR擴(kuò)增目的基因時,設(shè)計的引物只能與模板鏈在3'端配對,其原因是
。
(2)為獲得能正確表達(dá)的重組質(zhì)粒,應(yīng)分別使用哪些限制酶對質(zhì)粒、含強(qiáng)啟動子和AFPs基因的DNA片段進(jìn)行切割:
、
。
(3)已知基因表達(dá)載體乙的長度為6.7Kb,M基因片段長度為0.6kb,強(qiáng)啟動子+AFPs基因片段的長度為2.8kb,推測表達(dá)載體甲的長度約為
kb。
(4)抗凍相關(guān)基因超量表達(dá)依賴于適宜的啟動子。啟動子可分為組成型啟動子(每種組織器官中均發(fā)揮作用)、組織特異型啟動子(特定組織器官中才能發(fā)揮作用)和誘導(dǎo)型啟動子(特定條件刺激下才能發(fā)揮作用),構(gòu)建基因表達(dá)載體時可單獨(dú)使用某一類型的啟動子,也可組合使用多種類型的啟動子。從減少物質(zhì)和能量消耗的角度出發(fā),最好選擇
,使番茄果實在寒冷刺激下才啟動抗寒基因的表達(dá)。
(5)對轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行鑒定時發(fā)現(xiàn),有些植株雖有AFPs基因,但幾乎沒有AFPs蛋白,造成該現(xiàn)象的原因可能有
。(答出2項即可)