24．黃瓜花葉病毒能感染多種植物，對(duì)煙草的危害尤其嚴(yán)重。病毒的Cu-4基因表達(dá)所形成的蛋白是子代病毒形成和釋放的關(guān)鍵蛋白，研究人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得能表達(dá)Cu-4基因反義RNA的轉(zhuǎn)基因煙草，反義RNA與Cu-4基因轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA互補(bǔ)結(jié)合形成雙鏈RNA，阻止了mRNA的翻譯，從而獲得了抵抗該病毒的能力。在Cu-4基因（A鏈?zhǔn)悄０彐湥┮粋?cè)連接了帶有細(xì)菌啟動(dòng)子的四環(huán)素抗性基因（在植物細(xì)胞該基因會(huì)被完整切除），如圖1所示。圖2是Ti質(zhì)粒相關(guān)基因圖譜。
?
備注：
1.Cu-4基因長度為300bp,tet
r基因長度為500bp。Ⅰ—Ⅳ是四種引物。
2.LB和RB是T-DNA的邊界，XhoⅠ和EcoRⅠ是兩種限制酶，切割后形成的黏性末端不互補(bǔ)。P
3ss和T
RBC是僅在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子。tet
r和amp
r分別是四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。所用農(nóng)桿菌不具有氨芐青霉素、四環(huán)素和潮霉素抗性。
（1）人工合成如圖1所示的DNA片段后，利用引物組合
（A.引物Ⅰ和Ⅳ；B.引物Ⅱ和Ⅲ；C.引物Ⅰ和Ⅲ；D.引物Ⅱ和Ⅳ）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為使圖1所示的DNA片段能與載體正確連接，在引物的5′端分別添加
酶的識(shí)別序列。將Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，可使用含有
的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。
（2）在將農(nóng)桿菌接種在煙草葉片前用砂紙輕微摩擦煙草葉片，目的是
。接種一段時(shí)間后，將煙草葉片酶解，獲取分散的葉肉細(xì)胞。將葉肉細(xì)胞培養(yǎng)在含有潮霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，其中潮霉素的作用是
。
（3）提取葉肉細(xì)胞的總DNA，酶切后用相應(yīng)的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后若觀察到長度
的片段，則說明所需的基因?qū)胫参锛?xì)胞中。
（4）將具有黃瓜花葉病毒抗性的煙草進(jìn)行自然種植時(shí)，需考慮轉(zhuǎn)基因作物帶來的
問題。研究人員發(fā)現(xiàn)將目的基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞線粒體或葉綠體中可降低基因漂移發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，原理是
。
