黃瓜花葉病毒能感染多種植物,對(duì)煙草的危害尤其嚴(yán)重。病毒的Cu-4基因表達(dá)所形成的蛋白是子代病毒形成和釋放的關(guān)鍵蛋白,研究人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得能表達(dá)Cu-4基因反義RNA的轉(zhuǎn)基因煙草,反義RNA與Cu-4基因轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA互補(bǔ)結(jié)合形成雙鏈RNA,阻止了mRNA的翻譯,從而獲得了抵抗該病毒的能力。在Cu-4基因(A鏈?zhǔn)悄0彐湥┮粋?cè)連接了帶有細(xì)菌啟動(dòng)子的四環(huán)素抗性基因(在植物細(xì)胞該基因會(huì)被完整切除),如圖1所示。圖2是Ti質(zhì)粒相關(guān)基因圖譜。
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備注:
1.Cu-4基因長(zhǎng)度為300bp,tet
r基因長(zhǎng)度為500bp。Ⅰ—Ⅳ是四種引物。
2.LB和RB是T-DNA的邊界,XhoⅠ和EcoRⅠ是兩種限制酶,切割后形成的黏性末端不互補(bǔ)。P
3ss和T
RBC是僅在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子。tet
r和amp
r分別是四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。所用農(nóng)桿菌不具有氨芐青霉素、四環(huán)素和潮霉素抗性。
(1)人工合成如圖1所示的DNA片段后,利用引物組合
B
B
(A.引物Ⅰ和Ⅳ;B.引物Ⅱ和Ⅲ;C.引物Ⅰ和Ⅲ;D.引物Ⅱ和Ⅳ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,為使圖1所示的DNA片段能與載體正確連接,在引物的5′端分別添加
XhoⅠ和EcoRⅠ
XhoⅠ和EcoRⅠ
酶的識(shí)別序列。將Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌后,可使用含有
四環(huán)素
四環(huán)素
的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。
(2)在將農(nóng)桿菌接種在煙草葉片前用砂紙輕微摩擦煙草葉片,目的是
增加葉片傷口數(shù)量,提高農(nóng)桿菌侵染成功率
增加葉片傷口數(shù)量,提高農(nóng)桿菌侵染成功率
。接種一段時(shí)間后,將煙草葉片酶解,獲取分散的葉肉細(xì)胞。將葉肉細(xì)胞培養(yǎng)在含有潮霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng),其中潮霉素的作用是
去除農(nóng)桿菌
去除農(nóng)桿菌
。
(3)提取葉肉細(xì)胞的總DNA,酶切后用相應(yīng)的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增,電泳后若觀察到長(zhǎng)度
300bp
300bp
的片段,則說(shuō)明所需的基因?qū)胫参锛?xì)胞中。
(4)將具有黃瓜花葉病毒抗性的煙草進(jìn)行自然種植時(shí),需考慮轉(zhuǎn)基因作物帶來(lái)的
安全性
安全性
問(wèn)題。研究人員發(fā)現(xiàn)將目的基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞線粒體或葉綠體中可降低基因漂移發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),原理是
基因漂變常通過(guò)傳粉過(guò)程進(jìn)行,而受精過(guò)程中,雄配子只有細(xì)胞核基因傳遞給了下一代,細(xì)胞質(zhì)基因并未傳給下一代(即細(xì)胞質(zhì)基因不能通過(guò)花粉或精子傳遞給下一代)
基因漂變常通過(guò)傳粉過(guò)程進(jìn)行,而受精過(guò)程中,雄配子只有細(xì)胞核基因傳遞給了下一代,細(xì)胞質(zhì)基因并未傳給下一代(即細(xì)胞質(zhì)基因不能通過(guò)花粉或精子傳遞給下一代)
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