研究者利用基因組編輯技術(shù)，將Bcl-2（抗凋亡）基因定點敲入FUT8（巖藻糖轉(zhuǎn)移酶）基因，從而改造中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞。
（1）Cas9蛋白和sgRNA是基因組編輯工具（圖1），為篩選進行高效編輯的sgRNA，需根據(jù) FUT8FUT8基因相應(yīng)序列，設(shè)計并合成多個sgRNA鏈。分別構(gòu)建sgRNA/Cas9表達質(zhì)粒，并通過 顯微注射顯微注射法導(dǎo)入CHO細(xì)胞。
（2）Cas9蛋白與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷，隨后細(xì)胞會通過DNA損傷修復(fù)機制，將斷裂處兩端的序列連接起來，但在缺口處會發(fā)生堿基錯配。T酶能特異性識別并切割錯配的雙鏈DNA，通過T酶的酶切實驗檢測sgRNA在CHO細(xì)胞內(nèi)編輯效率。對圖2電泳結(jié)果分析，2、3、42、3、4組實現(xiàn)sgRNA的高效編輯。
（3）將含目的基因表達框和sgRNA/Cas9表達質(zhì)粒（1：1）共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，實現(xiàn)同步敲入敲除基因，具體過程如圖3。
①目的基因表達框中含基因表達所需的元件，元件順序依次為：同源序列Ⅰ-b-d-a-f-cb-d-a-f-c-同源序列Ⅱ，cc元件導(dǎo)致FUT8基因靶點后序列沒有成功轉(zhuǎn)錄。（填選項）
a、T2A（連接子）
b、啟動子
c、轉(zhuǎn)錄終止信號
d、Bcl-2基因
e、FUT8基因
f、綠色熒光蛋白基因
②選取具有 綠色熒光綠色熒光特征的細(xì)胞，進一步提取基因組DNA，并對圖3中片段 1、2、31、2、3進行PCR，篩選出在FUT8靶基因處成功整合目的基因表達框的單克隆細(xì)胞。若PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果出現(xiàn) 長度約4768bp的（明亮）單一條帶長度約4768bp的（明亮）單一條帶，表明篩選出的單克隆細(xì)胞為成功定點整合的純合細(xì)胞。
（4）CHO細(xì)胞是基因工程中生產(chǎn)抗體的常用受體細(xì)胞，F(xiàn)UT8負(fù)責(zé)將巖藻糖轉(zhuǎn)移至表達抗體上，而巖藻糖的存在會極大地降低抗體的作用。請分析利用改造后的CHO細(xì)胞株進行抗體生產(chǎn)的優(yōu)勢 改造后的CHO細(xì)胞株具有Bcl-2基因不易發(fā)生細(xì)胞凋亡，利于進行抗體的大規(guī)模生產(chǎn)；同時其生產(chǎn)的抗體無巖藻糖修飾，利于發(fā)揮抗體的作用改造后的CHO細(xì)胞株具有Bcl-2基因不易發(fā)生細(xì)胞凋亡，利于進行抗體的大規(guī)模生產(chǎn)；同時其生產(chǎn)的抗體無巖藻糖修飾，利于發(fā)揮抗體的作用。
【答案】FUT8；顯微注射；2、3、4；b-d-a-f-c；c；綠色熒光；1、2、3；長度約4768bp的（明亮）單一條帶；改造后的CHO細(xì)胞株具有Bcl-2基因不易發(fā)生細(xì)胞凋亡，利于進行抗體的大規(guī)模生產(chǎn)；同時其生產(chǎn)的抗體無巖藻糖修飾，利于發(fā)揮抗體的作用
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/4/20 14:35:0組卷：55引用：2難度：0.5
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1．人類基因組計劃測定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
2．學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進行無義突變遺傳病的治療
無義突變是由于某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質(zhì)的功能改變，引發(fā)相關(guān)疾病。約有10%～15%的人類基因相關(guān)遺傳疾病是由無義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正常基因的cDNA序列或是有治療價值的基因（如CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯工具）通過一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，達到替代或修復(fù)缺陷基因、治療疾病的目的。導(dǎo)入基因插入位置不當(dāng)、過高或過低表達，都可能會導(dǎo)致副作用。盡管基因編輯可以實現(xiàn)生理水平的基因表達，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強烈的免疫反應(yīng)仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來，它的反密碼子通過堿基配對原則可以識別無義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無義突變位點時不啟動翻譯終止而是繼續(xù)向后進行翻譯，獲得有功能的全長蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關(guān)基因發(fā)生無義突變，產(chǎn)生終止密碼子UAG。研究者構(gòu)建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對該無義突變設(shè)計的sup-tRNA表達載體（產(chǎn)生的sup-tRNA能夠識別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡寫作sup-tRNATyr），將其導(dǎo)入細(xì)胞進行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進一步利用重組腺相關(guān)病毒作為載體將sup-tRNA導(dǎo)入患病小鼠模型中，實驗顯示能夠降低黏多糖過度積存，實現(xiàn)對該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來看，G418在促進跨越無義突變位點繼續(xù)翻譯時引入的氨基酸較為隨機，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個體治療中具有很高的安全性，因而在未來基因突變引起的疾病相關(guān)治療中具有非常大的應(yīng)用前景。
（1）侵染時，作為載體的重組腺相關(guān)病毒與靶細(xì)胞膜上的發(fā)生識別，引發(fā)內(nèi)吞，進入細(xì)胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細(xì)胞的催化合成其互補DNA鏈，再經(jīng)過過程產(chǎn)生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構(gòu)建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過檢測來確定是否跨越無義突變位點繼續(xù)向后翻譯。實驗結(jié)果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進無義突變位點的翻譯方面更加有效，支持這一結(jié)論的依據(jù)是：。
（4）有文獻報道，已在近1000個不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個無義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設(shè)計獨特的治療策略，這將是一項耗費驚人的項目。據(jù)此說明sup-tRNA的應(yīng)用價值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：27引用：1難度：0.6 -
3．幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，自然界有些植物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解從而抵抗真菌感染。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入沒有抗性的植物體內(nèi)，可增強其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質(zhì)酶基因而建立cDNA文庫的過程。
（1）圖示以mRNA為材料通過法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過這種方法獲得的基因中因缺乏和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致將其直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中不能復(fù)制和表達。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫中獲得的幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來，構(gòu)建基因表達載體，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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