科研人員研究調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(SUC2)的兩種蛋白質(zhì)Snf1和Snf2之間的相互作用的原理如下:真核細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的,由DNA結(jié)構(gòu)功能域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)組成。兩個結(jié)構(gòu)域分開時不能激活轉(zhuǎn)錄,只有當(dāng)兩者空間上接近時,才具有GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性。BD與基因上游激活序列UAS結(jié)合后,激活A(yù)D與啟動子結(jié)合,使啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄。如圖1為研究相互作用的X蛋白和Y蛋白的機制模式圖。
(1)操作中,需要用 限制酶和DNA連接限制酶和DNA連接酶將目的基因分別插入到酵母表達載體中,得到兩種融合表達載體(如2圖)。酶切時通常選用兩種不同的酶,這樣做的目的是 產(chǎn)生不同的黏性末端,保證目的基因按正確的方向連接;防止自身環(huán)化產(chǎn)生不同的黏性末端,保證目的基因按正確的方向連接;防止自身環(huán)化。
(2)酵母染色體上能被GAL4激活轉(zhuǎn)錄,顯示兩種蛋白質(zhì)相互作用的基因稱為報告基因。若用AUR1-C(抗生素AbA抗性基因)和HIS3(組氨酸合成基因)作為報告基因,那么作為被轉(zhuǎn)化的酵母細胞在抗生素抗性和營養(yǎng)需求上應(yīng)滿足的條件是 無AbA抗性、組氨酸缺陷無AbA抗性、組氨酸缺陷。轉(zhuǎn)化后需要在添加 AbA和不含組氨酸AbA和不含組氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選。除此之外,還要將酵母的GAL4基因敲除,原因是 排除細胞內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子GAL4的影響排除細胞內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子GAL4的影響。
(3)LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal產(chǎn)生藍色物質(zhì),使菌落呈現(xiàn)藍色;否則菌落為白色。科研人員采用LacZ作為報告基因,根據(jù)上述原理,驗證了蛋白質(zhì)Snf1和Snf2之間存在相互作用。寫出實驗思路并預(yù)期結(jié)果及推論。
【考點】基因工程的操作過程綜合.
【答案】限制酶和DNA連接;產(chǎn)生不同的黏性末端,保證目的基因按正確的方向連接;防止自身環(huán)化;無AbA抗性、組氨酸缺陷;AbA和不含組氨酸;排除細胞內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子GAL4的影響
【解答】
【點評】
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