回答用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因水稻的相關(guān)問(wèn)題：
（1）選擇使用

切割后形成不同粘性末端（識(shí)別并切割不同核苷酸序列）

切割后形成不同粘性末端（識(shí)別并切割不同核苷酸序列）

的兩種限制性核酸內(nèi)切酶，對(duì)含目的基因的DNA片段和T質(zhì)粒進(jìn)行處理，然后用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒。兩種限制性核酸內(nèi)切酶作用可以避免自身環(huán)化和

反向連接（任意方向連接；連接方向不定）

反向連接（任意方向連接；連接方向不定）

。
（2）取

氯化鈣（鈣離子）

氯化鈣（鈣離子）

處理過(guò)的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進(jìn)行混合等操作，使重組質(zhì)粒進(jìn)入農(nóng)桿菌，完成轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。然后在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，其目的是

使CaCl₂處理過(guò)的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)

使CaCl₂處理過(guò)的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài)

。
（3）用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和水稻細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，使攜帶目的基因的T-DNA片段移到水稻細(xì)胞并將其插入到水稻細(xì)胞的

基因組（染色體）

基因組（染色體）

中，保證目的基因在水稻細(xì)胞中穩(wěn)定和高效地表達(dá)。共培養(yǎng)后，外植體需要轉(zhuǎn)移到含有

抗生素

抗生素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，然后才能進(jìn)行植物組織培養(yǎng)。
（4）獲得目的基因的水稻細(xì)胞經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再以

適當(dāng)配比的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

適當(dāng)配比的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

誘導(dǎo)，直至再生出新植株。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有：植物激素配比、愈傷組織繼代的次數(shù)，以及

光照、溫度、水稻基因型（pH）

光照、溫度、水稻基因型（pH）

（答出2點(diǎn)即可）