癌細(xì)胞表面蛋白“PDL-1”與T細(xì)胞表面蛋白“PD-1”特異性結(jié)合后，可抑制T細(xì)胞活性并啟動(dòng)其凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫“逃逸”。研究者對(duì)“PD-1”基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定，為制備抗體打基礎(chǔ)。研究中所用引物α和β堿基序列見(jiàn)圖1、幾種常用限制酶名稱及識(shí)別序列與酶切位點(diǎn)見(jiàn)圖2：

（1）首先提取細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成

cDNA

cDNA

作為模板：設(shè)計(jì)含有不同的限制酶切點(diǎn)的α和β序列為引物，通過(guò)

PCR

PCR

技術(shù)擴(kuò)增目的基因。
（2）選用圖1中的兩種名稱分別為

XhoI、EcoRI

XhoI、EcoRI

的限制酶將“pIRES2-EGFP質(zhì)?！陛d體進(jìn)行雙切，再用DNA連接酶將其與目的基因拼接，構(gòu)建表達(dá)載體。該表達(dá)載體的組成，除了目的基因、標(biāo)記基因抗卡那霉素基因外，還必須具有

啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)

啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)

等
（3）而后一定溫度下，與經(jīng)過(guò)Ca²⁺處理的感受態(tài)大腸桿菌混合培養(yǎng)在含有

卡那霉素

卡那霉素

培養(yǎng)基中，可篩選出已經(jīng)完成轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)該種大腸桿菌以擴(kuò)增重組DNA。
（4）將擴(kuò)增后的“pIRES2-EGFP載體/PD-1重組DNA”轉(zhuǎn)入可高度表達(dá)外源基因的原代293T細(xì)胞。一段時(shí)間后，為確定PD-1基因是否表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞膜表面是否具有

PD-1蛋白

PD-1蛋白

。為判斷其是否具有生物學(xué)活性和功能，則可裂解293T細(xì)胞，提取該物質(zhì)看能否與

PDL-1或答ⅣD-1抗體

PDL-1或答ⅣD-1抗體

發(fā)生結(jié)合，從而阻斷“PD-1與PDL-1信號(hào)通路”。研究中還會(huì)有一步驟，只將“pIRES2-EGFP載體”轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，其目的是

作為對(duì)照

作為對(duì)照

。