為提高小對磷元素的吸收能力，研究人員通過質(zhì)粒P把水稻耐低磷因?qū)胄←溂?xì)胞得到耐低磷轉(zhuǎn)基因小麥，基本流程如圖。質(zhì)粒P含3種限制酶（NheⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ）切割位點(diǎn)，全部切割可以得到F₁、F₂、F₃、F₄片段，標(biāo)記基因和啟動子分別位F₁和F₂片段中。耐低磷基因兩側(cè)的限制酶切割位點(diǎn)為NheⅠ和SalⅠ，據(jù)圖回答下列問題：

（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

法，還有基因槍法和我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的

花粉管通道

花粉管通道

法。
（2）有人將質(zhì)粒P用NheⅠ與SalⅠ雙酶切割后，與耐低磷基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到的重組質(zhì)粒不一定都是所需要的，原因是

質(zhì)粒P有兩個NheⅠ的酶切位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)?？赡苡校孩僦缓現(xiàn)₄和耐低磷基因②只含F(xiàn)₃和耐低磷基因③F₄、耐低磷基因和F₂-F₁片段（反向連接）④F₃、耐低磷基因和F₂-F₁片段（反向連接）⑤F₃、耐低磷基因和F₁-F₂片段。不符合要求

質(zhì)粒P有兩個NheⅠ的酶切位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)?？赡苡校孩僦缓現(xiàn)₄和耐低磷基因②只含F(xiàn)₃和耐低磷基因③F₄、耐低磷基因和F₂-F₁片段（反向連接）④F₃、耐低磷基因和F₂-F₁片段（反向連接）⑤F₃、耐低磷基因和F₁-F₂片段。不符合要求

。因此，需采取以下步驟進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建：
第一步，取質(zhì)粒P用

EcoRⅠ

EcoRⅠ

和

SalⅠ

SalⅠ

酶切測，從中選取

F₁+F₄

F₁+F₄

片段備用；
第二步，另取質(zhì)粒P用

EcoRⅠ

EcoRⅠ

和

NheⅠ

NheⅠ

酶切割，從中選取

F_ρ

F_ρ

片段備用；
第三步，將耐低磷基因與前兩步選取的片段用DNA連接酶連接即可得到所需重組質(zhì)粒。
（3）剝?nèi)⌒←湻N子的幼胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)

脫分化

脫分化

形成愈傷組織，該過程需要的植物激素有

細(xì)胞分裂素和生長素

細(xì)胞分裂素和生長素

，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入愈傷組織，培養(yǎng)一段時間后，還需要轉(zhuǎn)移至

分化

分化

培養(yǎng)基上。