干燥綜合征(SS)是一種自身免疫病,患者血清中存在多種抗體,其中SSB抗體特異性最強(qiáng)。科研人員為生產(chǎn)SSB抗體的檢測(cè)試劑,利用基因工程獲得重組SSB蛋白,流程如下,請(qǐng)回答:
(1)利用RNA通過①過程獲得cDNA需要
逆轉(zhuǎn)錄
逆轉(zhuǎn)錄
酶,從而獲得SSB基因,SSB基因通過PCR擴(kuò)增,其延伸階段需要 耐高溫的DNA聚合
耐高溫的DNA聚合
酶的參與,而且在緩沖液中添加 Mg2+
Mg2+
以便激活該酶的活性。目的基因片段擴(kuò)增n代,共需要 2n+1-2
2n+1-2
個(gè)引物。
(2)PCR循環(huán)之前,常要進(jìn)行一次預(yù)變性,預(yù)變性的目的是增加 模板DNA徹底變性
模板DNA徹底變性
的概率,用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí) 不必
不必
(填“必須”或“不必”)知道基因的全部序列。
(3)為與PET41a質(zhì)粒連接,獲得的目的基因A兩端要含有 BamHI和XhoI
BamHI和XhoI
(寫出限制酶名稱)酶切位點(diǎn)。DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是 磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
。
(4)獲得含SSB基因的重組質(zhì)粒后,進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)切割原質(zhì)粒和重組質(zhì)粒,獲得片段大小見表格(1kb=1000堿基對(duì)),分析數(shù)據(jù),計(jì)算可得SSB基因的長(zhǎng)度為 3Kb
3Kb
。與人基因組文庫(kù)中的SSB基因相比,通過①過程獲得的SSB基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 無(wú)
無(wú)
(填“有”或“無(wú)”)啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子等非編碼序列。
限制酶 |
EcoRI |
BanHI和XhoI |
原質(zhì)粒 |
8.1kb |
2.7kb、5.4kb |
重組質(zhì)粒 |
3.4kb、5.0kb |
未做該處理 |
(5)②過程目的是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到用
Ca2+
Ca2+
處理過的大腸桿菌內(nèi),并接種于添加
卡那霉素
卡那霉素
的培養(yǎng)基上,收集菌落進(jìn)行鑒定,將陽(yáng)性菌落進(jìn)一步純化后再將菌體破碎處理,篩選得到重組SSB蛋白。