堿性蛋白酶廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、醫(yī)療等行業(yè)。為了實現(xiàn)低成本高產(chǎn)量的目標(biāo)，研究人員通過誘變技術(shù)獲得高效分泌堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌，再利用基因工程手段將該地衣芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因（Apr）導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建了表達胞外堿性蛋白酶的重組菌株。回答下列問題：
（1）在誘變處理過程中，地衣芽孢桿菌發(fā)生了

基因突變

基因突變

（填變異類型）。由于該種變異具有

不定向性

不定向性

的特點，故誘變后還需經(jīng)過

鑒定和篩選

鑒定和篩選

才有可能獲得高效分泌堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌。
（2）Apr基因兩端的核苷酸序列已知，如圖1所示。利用PCR技術(shù)擴增Apr基因所需要的引物是下列中的

AB

AB

。

A．5′-GGATCTAACGCGATACGC-3′
B．5′-CTCGAGCCGGAAATACTT-3′
C．5′-AAGTATTTCCGGCTCGAG-3′
D．5′-GCGTATCGCGTTAGATCC-3′
（3）PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，除目的基因條帶外，還有2條非特異條帶，可能的原因有：
①引物序列較

短

短

（填“長”或“短”）導(dǎo)致引物與模板中非目的基因的片段結(jié)合；
②引物和模板

不完全配對

不完全配對

（填“完全配對”或“不完全配對”）導(dǎo)致引物與模板中非目的基因的片段結(jié)合。
（4）構(gòu)建基因表達載體時需要的工具酶有

限制酶和DNA連接酶

限制酶和DNA連接酶

。圖2是已構(gòu)建的重組表達載體pET-28b（+）-Apr的示意圖，將該表達載體導(dǎo)入大腸桿菌細胞時，研究人員一般先用Ca²⁺處理大腸桿菌細胞，使細胞處于

感受態(tài)

感受態(tài)

的生理狀態(tài)。據(jù)圖可知，若目的基因已成功導(dǎo)入到大腸桿菌細胞內(nèi)，則用XhoⅠ和NcoⅠ兩種酶（酶切位點見圖2所示）對重組菌株的DNA進行雙酶切，可得到約為

1110

1110

bp和

5231

5231

bp的DNA片段。
（5）研究人員研究了葡萄糖濃度對所獲重組菌株葡萄糖利用率和其分泌的蛋白酶活性的影響，實驗結(jié)果如圖3所示。據(jù)圖分析，培養(yǎng)重組菌株的最佳葡萄糖濃度為

8g/L

8g/L

，判斷理由是

該濃度下葡萄糖利用率較高且酶活性最大

該濃度下葡萄糖利用率較高且酶活性最大

。