科研人員發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中LMNA基因表達(dá)異常，LMNA基因編碼人體A型和C型核纖層蛋白，核纖層蛋白與維持細(xì)胞核正常形態(tài)有關(guān)?？蒲腥藛T利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2（人源肺癌細(xì)胞）細(xì)胞株進(jìn)行基因編輯，獲得了LMNA基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下。
（1）Cas9是一種核酸內(nèi)切酶，它與sgRNA構(gòu)成的復(fù)合體能與DNA分子特定堿基序列結(jié)合，如圖1．作用原理是sgRNA與DNA單鏈進(jìn)行

堿基互補(bǔ)配對(duì)

堿基互補(bǔ)配對(duì)

，并在PAM序列（幾乎存在于所有基因中），上游切斷DNA雙鏈。Cas9來(lái)自細(xì)菌，HepG2細(xì)胞中沒(méi)有編碼Cas9的基因，需將Cas9基因及雙鏈sgRNA拼接后形成

目的基因

目的基因

與質(zhì)粒結(jié)合，導(dǎo)入HepG2細(xì)胞。

（2）用圖2質(zhì)粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段（其上有三個(gè)酶切位點(diǎn)）構(gòu)建表達(dá)載體，應(yīng)選用

EcoRⅠ

EcoRⅠ

進(jìn)行酶切。將構(gòu)建好的表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)菌置于適宜反應(yīng)體系中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)菌涂布于含

嘌呤霉素

嘌呤霉素

的平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，24h后挑取菌落，提取質(zhì)粒作為模板，選擇圖3中引物組合

Ⅰ和Ⅲ

Ⅰ和Ⅲ

，通過(guò)PCR和電泳技術(shù)鑒定是否重組成功。

（3）用鑒定成功的工程菌對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)三天后收集HepG2細(xì)胞，從分子水平和細(xì)胞水平檢測(cè)導(dǎo)入是否成功。
①提取HepG2細(xì)胞的基因組，對(duì)DNA分子的

堿基序列

堿基序列

進(jìn)行檢測(cè)。
②請(qǐng)寫(xiě)出細(xì)胞水平的兩項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)

HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)、單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)量

HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)、單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)量

。
（4）經(jīng)多種檢測(cè)，科研人員發(fā)現(xiàn)成功敲除了HepG2細(xì)胞的LMNA基因，并獲得了穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系。請(qǐng)圍繞該細(xì)胞系的科研價(jià)值和治療癌癥的價(jià)值等方面提出一個(gè)可研究的問(wèn)題

探究LMNA基因敲除后HepG2細(xì)胞功能改變的機(jī)制；探究LMNA基因突變對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響機(jī)制

探究LMNA基因敲除后HepG2細(xì)胞功能改變的機(jī)制；探究LMNA基因突變對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響機(jī)制

。