雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動(dòng)物領(lǐng)域的抗病毒治療?？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。如圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

限制酶	識(shí)別序列和切割位點(diǎn)
EcoRⅠ
BamHⅠ

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是

雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列

雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列

。科研人員還在兩種引物的一端分別加上了

GAATTC

GAATTC

和

GGATCC

GGATCC

序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，選擇的原則是

AC

AC

。
A．Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶只有一個(gè)切割位點(diǎn)
B．目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中，每種限制酶只有一個(gè)切割位點(diǎn)
C．酶切后，目的基因形成的兩個(gè)黏性末端序列不相同
D．酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個(gè)黏性末端序列相同
（2）步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的必需元件還有

復(fù)制原點(diǎn)

復(fù)制原點(diǎn)

，步驟③中需先用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。
（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過(guò)

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測(cè)出干擾素基因，其可能原因是

雞干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)霟煵萦鷤M織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄

雞干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)霟煵萦鷤M織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄

。
（4）用煙草花葉病毒對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和普通煙草進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，接種后第19天對(duì)照組植株進(jìn)入病情指數(shù)（植物受病毒侵染的嚴(yán)重程度）為100的平臺(tái)期，而轉(zhuǎn)基因植株在第

22

22

天才進(jìn)入平臺(tái)期，但此時(shí)的病情指數(shù)為79．說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能的原因有

實(shí)驗(yàn)得到的干擾素表達(dá)量較低，未能很好啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抗性或病毒接種量過(guò)大，相對(duì)來(lái)說(shuō)干擾素誘導(dǎo)調(diào)控作用滯后或植物體內(nèi)缺乏干擾素受體，導(dǎo)致外源基因表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)或調(diào)控作用減弱

實(shí)驗(yàn)得到的干擾素表達(dá)量較低，未能很好啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抗性或病毒接種量過(guò)大，相對(duì)來(lái)說(shuō)干擾素誘導(dǎo)調(diào)控作用滯后或植物體內(nèi)缺乏干擾素受體，導(dǎo)致外源基因表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)或調(diào)控作用減弱

。