11.野生茄子具有耐鹽基因StP5CS。研究人員擴增StP5CS基因并雙酶切該基因和改造后的中間載體pCAMBIA1301,經(jīng)DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物,最終得到圖1所示的植物表達載體pCAMBIA1301-StP5CS。將該植物表達載體導(dǎo)入植物細胞進而獲得了耐鹽植株?;卮鹣铝袉栴}:
(1)對野生茄子耐鹽基因StP5CS進行克隆,需要提取茄子幼嫩葉片的總RNA,在
的催化下合成cDNA。擴增StP5CS基因的上游引物為ZHPs:5'-CA-CATTTCTGCTCCTACATT-3',下游引物為ZHPa:5'-CTTCCTAAATACA-CAACTGGAT-3',兩種引物中C+G的比例保持一致主要是為了保證
。
(2)StP5CS基因PCR擴增的每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性和
三步,在循環(huán)前常要進行一次94℃、5min預(yù)變性,其目的是
。
(3)構(gòu)建耐鹽基因StP5CS表達載體時,用限制酶BamHⅠ和SmaⅠ切割質(zhì)粒pCAMBIA1301,15min后需將溫度從36℃升高至65℃左右并保溫20min,目的是
,從而終止酶切反應(yīng)。圖2是StP5CS基因示意圖,為使其能正確插入表達載體并成功表達,則圖中P處的堿基序列應(yīng)為5'-
-3'。
(4)若將該表達載體導(dǎo)入棉花細胞,可用
法,如用微量注射器將含StP5CS基因的DNA溶液直接注入子房中,除此之外,將目的基因?qū)胫参锛毎S玫姆椒ㄟ€有
。