25.癌細(xì)胞表面蛋白“PDL-1”與T細(xì)胞表面蛋白“PD-1”特異性結(jié)合后,可抑制T細(xì)胞活性并啟動(dòng)其凋亡程序,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫“逃逸”。研究者對(duì)“PD-1”基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定,為制備抗體打基礎(chǔ)。研究中所用引物α和β堿基序列見圖1,幾種常用限制酶名稱及識(shí)別序列與酶切位點(diǎn)見圖2:
(1)首先提取細(xì)胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA作為模板:設(shè)計(jì)含有不同的限制酶切位點(diǎn)的α和β序列為引物,通過
技術(shù)擴(kuò)增目的基因。
(2)為保證目的基因和載體正向連接,選用圖中的名稱為
的限制酶將質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行切割,再用DNA連接酶構(gòu)建表達(dá)載體。該表達(dá)載體的組成,除了目的基因、標(biāo)記基因(抗卡那霉素基因)外,還必須具有
等(寫出2點(diǎn)即可)。
(3)而后一定溫度下,與經(jīng)過Ca
2+處理的感受態(tài)大腸桿菌混合培養(yǎng)在含
培養(yǎng)基中,可篩選出已經(jīng)完成轉(zhuǎn)化的大腸桿菌,繼續(xù)培養(yǎng)該種大腸桿菌以擴(kuò)增重組DNA。
(4)將擴(kuò)增后的“載體A/PD-1重組DNA”轉(zhuǎn)入可高度表達(dá)外源基因的原代293T細(xì)胞。一段時(shí)間后,為確定PD-1基因是否表達(dá),檢測細(xì)胞膜表面是否具有
。研究中還會(huì)有一步驟是只將載體A轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,其目的是
。