24．紅景天中的HMA3基因能編碼Cd轉(zhuǎn)運蛋白，科研人員將紅景天中的HMA3基因轉(zhuǎn)入欒樹，以實現(xiàn)欒樹的定向改良，使其增強對Cd的富集能力，從而更有效治理Cd污染。實驗的主要流程如下，其中Hyg
r為潮霉素抗性基因，Kan
r為卡拉霉素抗性基因，請回答：
（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴增、保存
①從紅景天細胞中提取總RNA為模板，進行RTPCR。其中PCR的反應(yīng)條件：98℃10s,55℃30s,72℃1min,35個循環(huán)，其中55℃30s過程稱為
。若模板雙鏈cDNA的數(shù)量為a個，經(jīng)過35個循環(huán)需要消耗引物的數(shù)量是
。
②為構(gòu)建Cd轉(zhuǎn)運蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的融合蛋白，需確保目的基因與質(zhì)粒正確連接。構(gòu)建重組質(zhì)粒時用
酶切PCR純化產(chǎn)物（已添加相應(yīng)酶切位點）及Ti質(zhì)粒，然后通過DNA連接酶進行連接制備重組質(zhì)粒，并依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌。
（2）欒樹愈傷組織的誘導(dǎo)
切割無菌苗將其莖段插入愈傷組織培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)添加
（填植物激素的名稱），放入培養(yǎng)箱，經(jīng)過21d的黑暗誘導(dǎo)，莖段經(jīng)
形成愈傷組織。
（3）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的建立
將農(nóng)桿菌單克隆菌株對欒樹愈傷組織進行侵染轉(zhuǎn)化，并用添加
的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織，將愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)成完整植株。
（4）原生質(zhì)體制備及目的基因的檢測和鑒定
①取4g篩選后愈傷組織，用鑷子輕輕搗碎，沖洗。用濾網(wǎng)過濾溶液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含
的酶解液中處理一段時間獲得原生質(zhì)體。
②在激光共聚焦下觀測到細胞膜發(fā)出綠色熒光。在本研究中選擇GFP與Cd轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)建融合蛋白的目的是
。若要從個體生物學(xué)水平上進行目的基因的檢測與鑒定，則可以檢測比較轉(zhuǎn)基因欒樹與野生型欒樹
。
