人溶菌酶（hLTF）是人乳汁中重要的抗菌蛋白。某團(tuán)隊將hLTF基因連接到質(zhì)粒載體中構(gòu)建了hLTF基因表達(dá)載體，通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗菌蛋白。請回答：
（1）為實現(xiàn)hLTF基因的大量擴(kuò)增，可利用圖1中的引物 ②③②③組合進(jìn)行PCR．為保證hLTF基因和表達(dá)載體的充分連接，PCR擴(kuò)增時，應(yīng)在基因上、下游引物的 5′5′端分別添加相應(yīng)的酶切位點，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制酶酶切位點，主要目的是 使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連。
（2）Cre/loxp位點特異性重組系統(tǒng)可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞染色體（DNA）上基因的定點整合和重組。重組酶Cre能識別特異的DNA序列，即loxP位點，使loxP位點間的基因序列被刪除或重組，Cre/loxp介導(dǎo)三種不同的重組反應(yīng)。（如圖2）
①loxP位點是一段DNA序列，包括兩個反向重復(fù)序列和一個不對稱的間隔區(qū)組成反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區(qū)域決定了loxP位點的方向。Cre酶能特異性地識別反向重復(fù)序列并在特定位置切開磷酸二酯鍵，其功能類似于基因工程中的 限制限制酶。
②如果三種重組反應(yīng)均發(fā)生在染色體上，可能會導(dǎo)致染色體上基因的 缺失、倒位和易位缺失、倒位和易位，重組反應(yīng)的結(jié)果取決于 loxP位點的位置、同一染色體（DNA）上loxP位點的方向loxP位點的位置、同一染色體（DNA）上loxP位點的方向。
（3）構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器的方法有多種，一是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)氲绞芫阎校蛊渖L發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物：二是通過轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆動物作為生物反應(yīng)器。兩種方法獲得的胚胎都要借助 早期胚胎培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)和 胚胎移植胚胎移植技術(shù)才能獲得轉(zhuǎn)基因動物個體。
【答案】②③；5′；使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連；限制；缺失、倒位和易位；loxP位點的位置、同一染色體（DNA）上loxP位點的方向；早期胚胎培養(yǎng)；胚胎移植
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/6/27 10:35:59組卷：20引用：1難度：0.6
相似題
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1．學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進(jìn)行無義突變遺傳病的治療
無義突變是由于某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質(zhì)的功能改變，引發(fā)相關(guān)疾病。約有10%～15%的人類基因相關(guān)遺傳疾病是由無義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正?；虻腸DNA序列或是有治療價值的基因（如CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯工具）通過一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到替代或修復(fù)缺陷基因、治療疾病的目的。導(dǎo)入基因插入位置不當(dāng)、過高或過低表達(dá)，都可能會導(dǎo)致副作用。盡管基因編輯可以實現(xiàn)生理水平的基因表達(dá)，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強烈的免疫反應(yīng)仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來，它的反密碼子通過堿基配對原則可以識別無義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無義突變位點時不啟動翻譯終止而是繼續(xù)向后進(jìn)行翻譯，獲得有功能的全長蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關(guān)基因發(fā)生無義突變，產(chǎn)生終止密碼子UAG。研究者構(gòu)建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對該無義突變設(shè)計的sup-tRNA表達(dá)載體（產(chǎn)生的sup-tRNA能夠識別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡寫作sup-tRNATyr），將其導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進(jìn)一步利用重組腺相關(guān)病毒作為載體將sup-tRNA導(dǎo)入患病小鼠模型中，實驗顯示能夠降低黏多糖過度積存，實現(xiàn)對該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來看，G418在促進(jìn)跨越無義突變位點繼續(xù)翻譯時引入的氨基酸較為隨機，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個體治療中具有很高的安全性，因而在未來基因突變引起的疾病相關(guān)治療中具有非常大的應(yīng)用前景。
（1）侵染時，作為載體的重組腺相關(guān)病毒與靶細(xì)胞膜上的發(fā)生識別，引發(fā)內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細(xì)胞的催化合成其互補DNA鏈，再經(jīng)過過程產(chǎn)生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構(gòu)建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過檢測來確定是否跨越無義突變位點繼續(xù)向后翻譯。實驗結(jié)果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進(jìn)無義突變位點的翻譯方面更加有效，支持這一結(jié)論的依據(jù)是：。
（4）有文獻(xiàn)報道，已在近1000個不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個無義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設(shè)計獨特的治療策略，這將是一項耗費驚人的項目。據(jù)此說明sup-tRNA的應(yīng)用價值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：26引用：1難度：0.6 -
2．人類基因組計劃測定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
3．幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，自然界有些植物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解從而抵抗真菌感染。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入沒有抗性的植物體內(nèi)，可增強其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質(zhì)酶基因而建立cDNA文庫的過程。
（1）圖示以mRNA為材料通過法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過這種方法獲得的基因中因缺乏和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致將其直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中不能復(fù)制和表達(dá)。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫中獲得的幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來，構(gòu)建基因表達(dá)載體，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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