科研團(tuán)隊(duì)通過培養(yǎng)基因X敲除的小鼠以確定基因X的功能?？蒲腥藛T構(gòu)建了基因X置換載體，主要過程如圖1所示（G418可殺死動(dòng)物細(xì)胞），HSV-tK基因的表達(dá)產(chǎn)物能將DHPG（丙氧鳥苷）轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡；然后采用一定的方法將基因X的置換載體導(dǎo)入到小鼠特定細(xì)胞，在特定細(xì)胞中基因X的置換載體可以和染色體上目的基因所在區(qū)段發(fā)生同源重組，再通過篩選，即可得到打靶成功的細(xì)胞，也可以隨機(jī)插入到染色體中，主要過程如圖2所示；將符合要求的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)即可獲得基因X敲除的小鼠。

（1）研究發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定DNA聚合酶不能直接啟動(dòng)DNA新鏈的合成，即不能從頭合成DNA，因此PCR反應(yīng)體系中必需加入

引物

引物

。
（2）圖1中引物R₁和F₂的5′端分別添加了與引物F_G和R_G互補(bǔ)的序列。引物R₁的5′端添加與引物F_G互補(bǔ)序列的目的是

便于H₁和G_R拼接（便于形成 H₁+G_R融合基因）

便于H₁和G_R拼接（便于形成 H₁+G_R融合基因）

。在PCR5中加入的引物是

R₂和F_G

R₂和F_G

。
（3）圖2中的細(xì)胞一般是小鼠的

胚胎干細(xì)胞（或受精卵）

胚胎干細(xì)胞（或受精卵）

，常采用

顯微注射

顯微注射

法將基因X置換載體導(dǎo)入這些細(xì)胞。
（4）將置換載體導(dǎo)入特定細(xì)胞后，除了發(fā)生同源重組外，還會(huì)發(fā)生非同源重組，如圖2所示。為篩選出成功實(shí)現(xiàn)預(yù)期基因敲除的細(xì)胞，對培養(yǎng)基的要求是

含有G418和 DHPG（丙氧鳥苷）

含有G418和 DHPG（丙氧鳥苷）

，發(fā)生非同源重組獲得的細(xì)胞不能在此培養(yǎng)基上存活的原因是

發(fā)生非同源重組的細(xì)胞含有 HSV一tK基因，其表達(dá)產(chǎn)物會(huì)將 DHPG轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡

發(fā)生非同源重組的細(xì)胞含有 HSV一tK基因，其表達(dá)產(chǎn)物會(huì)將 DHPG轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡

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