研究發(fā)現(xiàn),實(shí)體腫瘤內(nèi)部通常是缺氧的環(huán)境,蓖麻毒素蛋白(RTA)可作用于核糖體,使蛋白合成受阻,從而引起細(xì)胞死亡。TAT是一種短肽,可轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞,含有氧依賴性降解區(qū)域ODD(多肽)的融合蛋白可以適應(yīng)低氧條件穩(wěn)定存在,但在常氧條件下會(huì)被蛋白酶降解??蒲腥藛T以RTA作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性分子,利用TAT的作用將融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,并利用ODD的作用減輕RTA對(duì)正常細(xì)胞的毒性,分別構(gòu)建了含TAT-RTA(660bp)和TAT-RTA-ODD(870bp)融合基因的表達(dá)載體,并成功得到相關(guān)融合蛋白。
(1)可采用PCR的方法獲取融合基因TAT-RTA,需要根據(jù)TAT和RTA基因設(shè)計(jì)引物,引物的作用是
與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)連接,并且使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸
與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)連接,并且使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸
。已知RTA基因和欲得到的TAT-RTA融合基因的結(jié)構(gòu)如圖1所示,TAT基因編碼鏈序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′,為順利構(gòu)建表達(dá)載體,需要在引物1的5′端加入 BamHⅠ
BamHⅠ
酶切位點(diǎn),引物2的5′端加入 XboⅠ
XboⅠ
酶切位點(diǎn),利用TAT和RTA核酸序列設(shè)計(jì)引物時(shí),要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽,請(qǐng)根據(jù)要求寫出引物1 5'GGATCCATGAGC3'
5'GGATCCATGAGC3'
(寫出引物5′端的12個(gè)堿基即可)。
(2)載體的部分結(jié)構(gòu)如圖2所示,His標(biāo)簽由連續(xù)的6個(gè)組氨酸構(gòu)成,可用于對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行分離純化,將PCR得到的TAT-RTA融合基因和載體雙酶切后,再用 DNA連接
DNA連接
酶連接。但是在研究時(shí),發(fā)現(xiàn)融合蛋白中沒有His標(biāo)簽蛋白,據(jù)圖分析原因是 限制酶2識(shí)別序列后面的一個(gè)堿基A與His標(biāo)簽基因編碼鏈的前兩個(gè)堿基CA編碼一個(gè)氨基酸,導(dǎo)致His標(biāo)簽基因?qū)?yīng)的mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取
限制酶2識(shí)別序列后面的一個(gè)堿基A與His標(biāo)簽基因編碼鏈的前兩個(gè)堿基CA編碼一個(gè)氨基酸,導(dǎo)致His標(biāo)簽基因?qū)?yīng)的mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取
??赏ㄟ^引物2的特殊設(shè)計(jì)使His標(biāo)簽正常表達(dá),請(qǐng)結(jié)合圖1和圖2寫出引物2 5'CTCGAGTAGAACTGGCTGCTCGGCGG3'
5'CTCGAGTAGAACTGGCTGCTCGGCGG3'
(引物中如需添加堿基補(bǔ)足對(duì)應(yīng)的密碼子,可以添加任意堿基)。
(3)科研人員將得到的重組融合蛋白經(jīng)腹腔給藥荷瘤小鼠(患實(shí)體腫瘤的小鼠稱為荷瘤小鼠),研究荷瘤小鼠腫瘤體積變化,結(jié)果如圖3所示,
請(qǐng)寫出本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 TAT-RTA和TAT-RTA-ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng),TAT-RTA-ODD融合蛋白的抑制效果更好
TAT-RTA和TAT-RTA-ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng),TAT-RTA-ODD融合蛋白的抑制效果更好
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產(chǎn)生該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是 含有氧依賴性降解區(qū)域ODD(多肽)的融合蛋白可以適應(yīng)腫瘤內(nèi)部低氧條件穩(wěn)定存在,從而更好地抑制腫瘤體積增長(zhǎng)
含有氧依賴性降解區(qū)域ODD(多肽)的融合蛋白可以適應(yīng)腫瘤內(nèi)部低氧條件穩(wěn)定存在,從而更好地抑制腫瘤體積增長(zhǎng)
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