基因定點(diǎn)突變是指按照特定的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換、重排等變異。圖甲是一種PCR介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變示意圖，圖乙是研究人員利用基因M1構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程。請回答下列問題：

（1）進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的PCR反應(yīng)體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加入

Taq酶、dNTP（緩沖液、Mg²⁺）等

Taq酶、dNTP（緩沖液、Mg²⁺）等

，圖甲所示的基因定點(diǎn)突變技術(shù)需要

3

3

次PCR，獲得產(chǎn)物A需要的引物是

引物1和引物3

引物1和引物3

。
（2）研究人員對PCR的中間產(chǎn)物A、B進(jìn)行純化后，利用圖中相關(guān)酶對基因M和產(chǎn)物A、B進(jìn)行充分酶切后得到不同的片段，長度（kb）如下表，則圖中基因敲除片段的長度為

0.23kb

0.23kb

，基因M1的長度為

6.09kb

6.09kb

。

	基因M	A	B
長度	3.24、2.8、0.15、0.13	2.8、0.09	3.24、0.05

（3）通過圖甲過程獲得的基因M1仍需要大量擴(kuò)增，此時(shí)選擇的引物是

引物1和引物2

引物1和引物2

，為了與圖乙中的Ti質(zhì)粒相連，還需要分別在它們的

5’

5’

端引入限制酶

HindⅢ、PstⅠ

HindⅢ、PstⅠ

的識(shí)別序列。
（4）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，M1基因必需插入到Ti質(zhì)粒的

T-DNA

T-DNA

中，原因是

Ti質(zhì)粒上的T-DNA能夠轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體上

Ti質(zhì)粒上的T-DNA能夠轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體上

。