纖毛是廣泛存在的細胞表面結構,功能異常可引起多種疾病。因此,研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題。
(1)纖毛結構如圖1所示,由細胞膜延伸形成的纖毛膜主要由
磷脂、蛋白質
磷脂、蛋白質
組成?;w由中心體轉變而來,中心體在有絲分裂中的功能是 發(fā)出星射線,形成紡錘體
發(fā)出星射線,形成紡錘體
。
(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常,為了分析纖毛相關基因X是否發(fā)生了變異,對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時,可通過交替調節(jié)鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來,溶液中添加NaCl至2.0mo1/L的目的是 溶解DNA
溶解DNA
。PCR擴增時,需在 耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
催化下,在引物 3′
3′
端進行DNA鏈的延伸,獲得擴增產物用于測序。
(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位,構建綠色熒光蛋白GFP與x的融合蛋白,融合蛋白具有綠色熒光,可示其在細胞內位置。將X-GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y,構建Y-M重組質粒(在EcoRⅤ位點插入片段)。請完成下表。
分步實驗目標 |
簡易操作、結果、分析 |
PCR鑒定正向重組質粒Y-M(圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭,代表方向) |
①選擇圖Ⅱ引物 a、b a、b ; ②PCR目的產物約為 1100 1100 bp。 |
確保M及連接處序列正確Y-M的連接處上游含有Hind III+EcoR V的識別序列,下游含有EcoR V+BamH I的識別序列 |
③質粒測序,圖Ⅲ中正確的是 Q4 Q4 (選填序列編號) |
檢測融合蛋白定位 |
④對照質粒Y-GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y-M分別導入細胞,發(fā)現對照組整個細胞均有綠色熒光,而實驗組熒光集中在纖毛基部,說明 X蛋白參與中心體形成 X蛋白參與中心體形成 。 |
(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化,采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA,經
逆轉錄
逆轉錄
形成cDNA作為模板,PCR擴增結果顯示,在總cDNA模板量相等的條件下,健康人Ct值為15,而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數)。從理論上估算,在PCR擴增20個循環(huán)的產物中,健康人樣品的目的產物大約是病人的
32
32
倍。