常用的PCR技術有實時熒光定量PCR、RT-PCR、重疊延伸PCR等，其中重疊延伸PCR技術是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，通過多次PCR擴增，從而獲得目的基因的方法。該技術在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應用前景。利用重疊延伸PCR技術進行定點突變可以實現(xiàn)對纖維素酶基因進行合理改造，其過程如圖1所示?；卮鹣铝袉栴}：

（1）PCR定點突變需要設計的引物是

引物b、引物c

引物b、引物c

；②過程獲得突變產(chǎn)物AD，需要使用的引物是

引物a和引物d

引物a和引物d

。
（2）在第一階段為獲得產(chǎn)物AB和產(chǎn)物CD，必須將引物a、b和引物c、d置于不同反應系統(tǒng)中，這是因為

引物b和引物c對應的堿基之間多數(shù)可以配對，在一個反應系統(tǒng)中配對后失效

引物b和引物c對應的堿基之間多數(shù)可以配對，在一個反應系統(tǒng)中配對后失效

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（3）新冠病毒常用“熒光RT-PCR技術”進行檢測。
①“熒光RT-PCR技術”所用的試劑盒中通常都應該含有

逆（反）轉錄酶、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶（Taq酶）

逆（反）轉錄酶、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶（Taq酶）

、熒光標記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖體系。
②用

用微量移液器

用微量移液器

向微量離心管中依次加入各組分，稍微進行

離心

離心

，使反應液集中在微量離心管底部，將微量離心管放入PCR儀設計好PCR儀的循環(huán)程序，進行PCR反應。
（4）在檢測過程中，隨著PCR的進行，反應產(chǎn)物不斷累積，“雜交雙鏈”熒光信號的強度也等比例增加。可通過熒光強度的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化從而得到一條熒光擴增曲線圖。
①“平臺期”出現(xiàn)的最可能的原因是

試劑盒中的原料、引物和探針數(shù)量一定，超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒光標記的“雜交雙鏈”不再增加

試劑盒中的原料、引物和探針數(shù)量一定，超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒光標記的“雜交雙鏈”不再增加

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②理論上，在檢測過程中有熒光標記的“雜交雙鏈”出現(xiàn)，則說明檢測結果呈

陽

陽

（填“陰”或“陽”）性，但為了保證檢測結果的準確性，一般要達到或超過閾值時才確診?，F(xiàn)有兩個待檢樣本，檢測時都出現(xiàn)了上述形態(tài)的曲線，但甲的a點比乙的a點明顯左移。請給這種結果做出科學合理的解釋（試劑盒合格且正常，操作過程規(guī)范且準確）：

甲樣本中的新冠病毒含量更高達到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少

甲樣本中的新冠病毒含量更高達到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少

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