塑料制品方便人們生活的同時(shí)，也造成了短時(shí)期難以降解的“白色污染“。研究人員欲比較大腸桿菌YT1和芽孢桿菌YP1兩類細(xì)菌降解塑料（主要成分為聚氯乙烯（PVC）、聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）等，兩類細(xì)菌主要降解PE）的能力，并通過(guò)基因工程拼接黃粉蟲(chóng)腸道內(nèi)菌株WZ的降解PVC的胞外酶基因A，培育降解塑料的“超級(jí)菌”。
（1）菌株的篩選。配制固體培養(yǎng)基，接種菌株后表層覆蓋0.1mm厚度的PE塑料。分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示：
| 培養(yǎng)基及接種菌株 |
培養(yǎng)基1 |
培養(yǎng)基2 |
培養(yǎng)基3 |
| 單獨(dú)培養(yǎng)并接種YT1 |
單獨(dú)培養(yǎng)并接種YP1 |
混合培養(yǎng)YT1和YP1后，選取YP1接種 |
| 降解圈（直徑D/mm） |
3.5 |
1.8 |
4.2 |
①在篩選分解PE塑料能力大小的菌株時(shí)，應(yīng)將兩類菌株接種到以
PE塑料
PE塑料
為唯一碳源的培養(yǎng)基，從功能上講，該培養(yǎng)基屬于
選擇培養(yǎng)基
選擇培養(yǎng)基
。
②篩選分解PE塑料能力強(qiáng)的菌株不能直接以降解圈的大小為指標(biāo)，其原因是
因?yàn)榫w繁殖力不同，形成的菌落大小不同
因?yàn)榫w繁殖力不同，形成的菌落大小不同
。培養(yǎng)基3中接種混合培養(yǎng)后的YP1，其降解圈直徑明顯加大，其原因可能是
YP1和YT1混合培養(yǎng)過(guò)程中，YP1菌株整合了YT1的對(duì)PE塑料高分解力的基因，發(fā)生了轉(zhuǎn)化
YP1和YT1混合培養(yǎng)過(guò)程中，YP1菌株整合了YT1的對(duì)PE塑料高分解力的基因，發(fā)生了轉(zhuǎn)化
。
（2）培育“超級(jí)菌”。對(duì)菌株WZ的A基因測(cè)序可知，如果在其調(diào)節(jié)功能區(qū)增加一個(gè)堿基對(duì)A/T，則可以大大增強(qiáng)其基因表達(dá)能力。通過(guò)經(jīng)典的大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)在體外改造A基因，操作過(guò)程如圖1。然后與圖2所示的質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，培育“超級(jí)菌“。
①利用大引物PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變需要進(jìn)行兩輪PCR（PCR和PCRa），在PCR，中獲得的大引物是指
以誘變引物延伸得到的DNA鏈為模板，引物1與之結(jié)合延伸得到的DNA子鏈
以誘變引物延伸得到的DNA鏈為模板，引物1與之結(jié)合延伸得到的DNA子鏈
，至少需要
4
4
個(gè)PCR循環(huán)才能獲得完整的改良A基因。
②構(gòu)建改良基因表達(dá)載體時(shí)，為實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒和改良基因的準(zhǔn)確連接，應(yīng)選用的限制酶是
XmaⅠ和BglⅡ
XmaⅠ和BglⅡ
。表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌株時(shí)，有的質(zhì)粒含有改良的A基因，有的質(zhì)粒為空白質(zhì)粒。在含氨芐青霉素和β-半乳糖苷的平板上培養(yǎng)一段時(shí)間后，其中白色菌落含有重組質(zhì)粒，判斷的依據(jù)是
含有改良基因A的重組質(zhì)粒不含有完整的LacZ基因，受體菌不能分泌分解β-半乳糖苷而使培養(yǎng)基變藍(lán)的酶
含有改良基因A的重組質(zhì)粒不含有完整的LacZ基因，受體菌不能分泌分解β-半乳糖苷而使培養(yǎng)基變藍(lán)的酶
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