四尾柵藻是一種淡水藻類,繁殖快、適應(yīng)性強,可作為制備生物柴油的重要原料之一。為提高四尾柵藻的油脂含量,研究人員將從含油量高的紫蘇中獲得的二酰甘油?;D(zhuǎn)移酶基因DGAT1與pBI121質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體,經(jīng)轉(zhuǎn)化成功獲得高產(chǎn)油脂四尾柵藻,主要研究過程如圖,其中DGAT1-F(5′-GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC-3′)和DGAT1-R(5′-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTTTTC-3′)是以DGAT1基因為依據(jù)設(shè)計的一對引物,LacZ基因編碼產(chǎn)物在X-gal和IPTG存在下,可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀,使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色,否則菌落呈現(xiàn)白色。請回答下列問題:
限制酶識別序列及切制位點 |
BamHⅠ |
5′G↓GATCC3’ |
SacⅠ |
5′GAGCT↓C3′ |
XbaⅠ |
5′T↓CTAGA3′ |
EcoRⅠ |
5′G↓AATTC3′ |
(1)過程①中需要的酶有
逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶
逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶
,過程②應(yīng)選用的限制酶是
BamHⅠ
BamHⅠ
和
XbaⅠ
XbaⅠ
。
(2)過程③經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌通過
稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法
(方法)接種到培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。為篩選獲得目標(biāo)菌株,培養(yǎng)基應(yīng)加入的成分有
氨芐青霉素、X-gal、IPTG
氨芐青霉素、X-gal、IPTG
。
(3)用兩種限制酶切割DGAT1和pB1121,將其連接成重組表達(dá)載體,并將其導(dǎo)入四尾柵藻細(xì)胞中,與單酶切相比,雙切酶的優(yōu)點是
使DGAT1基因能定向插入表達(dá)載體,防止目的基因與載體自身環(huán)化
使DGAT1基因能定向插入表達(dá)載體,防止目的基因與載體自身環(huán)化
(答出兩點即可)。
(4)為檢測表達(dá)載體轉(zhuǎn)化四尾柵藻的情況及確定目的基因是否表達(dá),研究人員進(jìn)行了如下實驗,請完成表格。
實驗步驟 |
簡要操作過程 |
初篩培養(yǎng) |
經(jīng)轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻接種于含 卡那霉素 卡那霉素 的BG11固體培養(yǎng)基并放置于人工氣候箱培養(yǎng),一段時間后觀察其生長情況 |
擴(kuò)大培養(yǎng) 擴(kuò)大培養(yǎng)
|
在BG11固體培養(yǎng)基上分別挑取數(shù)個單藻落接種至BG11液體培養(yǎng)基中光照搖床培養(yǎng),編號備用 |
PCR驗證 |
收集四尾柵藻藻體,提取基因組DNA,以DGAT1-F和DGAT1-R為引物,進(jìn)行PCR驗證,未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻作對照 |
油脂含量測定 |
利用索氏抽提法測定 等量的轉(zhuǎn)化后和未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻 等量的轉(zhuǎn)化后和未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻 的油脂含量 |
結(jié)果處理 |
統(tǒng)計并比較PCR驗證結(jié)果及藻體中油脂的含量 |