四尾柵藻是一種淡水藻類，繁殖快、適應(yīng)性強，可作為制備生物柴油的重要原料之一。為提高四尾柵藻的油脂含量，研究人員將從含油量高的紫蘇中獲得的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因DGAT1與pBI121質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化成功獲得高產(chǎn)油脂四尾柵藻，主要研究過程如圖，其中DGAT1-F（5′-GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC-3′）和DGAT1-R（5′-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTTTTC-3′）是以DGAT1基因為依據(jù)設(shè)計的一對引物，LacZ基因編碼產(chǎn)物在X-gal和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色。請回答下列問題：

限制酶識別序列及切制位點
BamHⅠ	5′G↓GATCC3’
SacⅠ	5′GAGCT↓C3′
XbaⅠ	5′T↓CTAGA3′
EcoRⅠ	5′G↓AATTC3′

（1）過程①中需要的酶有

逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶

逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶

，過程②應(yīng)選用的限制酶是

BamHⅠ

BamHⅠ

和

XbaⅠ

XbaⅠ

。
（2）過程③經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌通過

稀釋涂布平板法

稀釋涂布平板法

（方法）接種到培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。為篩選獲得目標(biāo)菌株，培養(yǎng)基應(yīng)加入的成分有

氨芐青霉素、X-gal、IPTG

氨芐青霉素、X-gal、IPTG

。
（3）用兩種限制酶切割DGAT1和pB1121，將其連接成重組表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入四尾柵藻細(xì)胞中，與單酶切相比，雙切酶的優(yōu)點是

使DGAT1基因能定向插入表達(dá)載體，防止目的基因與載體自身環(huán)化

使DGAT1基因能定向插入表達(dá)載體，防止目的基因與載體自身環(huán)化

（答出兩點即可）。
（4）為檢測表達(dá)載體轉(zhuǎn)化四尾柵藻的情況及確定目的基因是否表達(dá)，研究人員進(jìn)行了如下實驗，請完成表格。

實驗步驟	簡要操作過程
初篩培養(yǎng)	經(jīng)轉(zhuǎn)化后的四尾柵藻接種于含 卡那霉素 卡那霉素 的BG11固體培養(yǎng)基并放置于人工氣候箱培養(yǎng)，一段時間后觀察其生長情況
擴(kuò)大培養(yǎng) 擴(kuò)大培養(yǎng)	在BG11固體培養(yǎng)基上分別挑取數(shù)個單藻落接種至BG11液體培養(yǎng)基中光照搖床培養(yǎng)，編號備用
PCR驗證	收集四尾柵藻藻體，提取基因組DNA，以DGAT1-F和DGAT1-R為引物，進(jìn)行PCR驗證，未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻作對照
油脂含量測定	利用索氏抽提法測定 等量的轉(zhuǎn)化后和未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻 等量的轉(zhuǎn)化后和未轉(zhuǎn)化的四尾柵藻 的油脂含量
結(jié)果處理	統(tǒng)計并比較PCR驗證結(jié)果及藻體中油脂的含量