血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）只能在血管內(nèi)皮細胞中合成，具有調(diào)節(jié)凝血的功能。為了解決異種器官移植時引起凝血紊亂的問題，科研人員研究制備了豬血管內(nèi)皮特異性表達人血栓調(diào)節(jié)蛋白（hTM）的轉(zhuǎn)基因豬。如圖1表示部分研究過程，請回答問題。

注：ori為復制原點，T為終止子，puro為嘌呤霉素抗性基因，pTM為豬血栓調(diào)節(jié)蛋白，相關限制酶識別序列及切割位點如表：

限制酶	XhoⅠ	claⅠ	EcoRV
識別序列及切割位點	C↓TCGAG	AT↓CGAT	GAT↓ATC

（1）步驟①使用的限制酶是

XhoI、claI

XhoI、claI

，質(zhì)粒中插入pTM啟動子的目的是

使人血栓調(diào)節(jié)蛋白基因能在豬血管內(nèi)皮細胞中特異性表達

使人血栓調(diào)節(jié)蛋白基因能在豬血管內(nèi)皮細胞中特異性表達

。
（2）步驟②中研究人員設計并合成了以下引物。合成這些引物的原料是

4種脫氧核苷酸

4種脫氧核苷酸

，引物設計的依據(jù)有

hTM基因編碼區(qū)兩端的核苷酸序列

hTM基因編碼區(qū)兩端的核苷酸序列

、

claI、EcoRV

claI、EcoRV

兩種限制酶的識別序列。
引物1：ATCGATATGCTTGGGGTCCTGGTCCTTGGC
引物2：GATATCTCAGAGTCTCTCCGCCGTCCGCTC
（3）將步驟③獲得的質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ、EcoRⅤ酶切后電泳，結果如圖2，據(jù)結果可判斷目的基因

成功插入

成功插入

（填“成功插入”或“未插入”）質(zhì)粒。
（4）質(zhì)粒3經(jīng)電轉(zhuǎn)染導入豬胎兒成纖維細胞并接種至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48h后經(jīng)適宜的酶處理分散成單細胞，再按每孔一個細胞接種至96孔板中，加入

嘌呤霉素

嘌呤霉素

篩選獲得抗性細胞，再提取抗性細胞的DNA進行PCR鑒定，將呈

陽

陽

（填陽或陰）性的細胞留存待用。
（5）取留存細胞的細胞核，顯微注射到

減數(shù)第二次分裂中

減數(shù)第二次分裂中

時期的

去核卵母細胞

去核卵母細胞

中，再經(jīng)過

早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植

早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植

等技術獲得能表達人血栓調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)基因豬。