某種類(lèi)型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過(guò)影響這一過(guò)程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。
（1）為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿(mǎn)足的條件是
兩種引物分別與兩條模板鏈3'端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)
兩種引物分別與兩條模板鏈3'端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)
。為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的 5'端
5'端
（填“3′端”或“5′端”）。
（2）PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問(wèn)題的原因是 在轉(zhuǎn)錄得到的mRNA序列中，EcoRⅠ識(shí)別序列的后兩個(gè)堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，導(dǎo)致翻譯時(shí)核糖體讀取的密碼子順序發(fā)生改變，從而使翻譯出的氨基酸序列改變
在轉(zhuǎn)錄得到的mRNA序列中，EcoRⅠ識(shí)別序列的后兩個(gè)堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，導(dǎo)致翻譯時(shí)核糖體讀取的密碼子順序發(fā)生改變，從而使翻譯出的氨基酸序列改變
。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來(lái)解決該問(wèn)題，具體修改方案是 在EcoRⅠ識(shí)別序列前后增加堿基，使融合基因中FLAG基因的堿基數(shù)目加上P基因的堿基數(shù)為3的倍數(shù)，從而保證翻譯時(shí)P基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA也能被正確讀取
在EcoRⅠ識(shí)別序列前后增加堿基，使融合基因中FLAG基因的堿基數(shù)目加上P基因的堿基數(shù)為3的倍數(shù)，從而保證翻譯時(shí)P基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA也能被正確讀取
。
（3）融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照?qǐng)D乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測(cè)，藥物A的作用是 促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合
促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合
；由②④組或③⑤組的差異推測(cè)，P△中缺失的特定序列的作用是 P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列
P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列
。
（4）根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，藥物A治療該病的機(jī)理是 藥物A促進(jìn)UBC與P的結(jié)合，從而促進(jìn)蛋白P被蛋白酶識(shí)別并降解，達(dá)到治療的目的
藥物A促進(jìn)UBC與P的結(jié)合，從而促進(jìn)蛋白P被蛋白酶識(shí)別并降解，達(dá)到治療的目的
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