哺乳動物細胞產(chǎn)生的酶M在工業(yè)上極具應(yīng)用價值，現(xiàn)擬利用大腸桿菌大規(guī)模生產(chǎn)該酶。下圖1為根據(jù)哺乳動物細胞中酶M基因合成的cDNA序列（加在cDNA兩側(cè)的限制酶識別序列不影響基因的正確表達），圖2為質(zhì)粒pXY6的結(jié)構(gòu)示意圖，其中Van^R為萬古霉素抗性基因，GFP基因編碼綠色熒光蛋白，大腸桿菌中不具有這兩種基因。限制酶NsiⅠ、PstⅠ、SbfⅠ、BclⅠ和BspEⅠ識別序列及切割位點分別為ATGCA^↓T、CTGCA^↓G、CCTGCA^↓GG、T^↓GATCA和T^↓CCGGA。請回答下列問題：

（1）將哺乳動物的酶M基因直接導(dǎo)入大腸桿菌中，合成的蛋白質(zhì)的氨基酸序列較酶M長，可能的原因是

酶M基因中含有內(nèi)含子序列，在真核細胞轉(zhuǎn)錄后會切除，而大腸桿菌中不會被切除

酶M基因中含有內(nèi)含子序列，在真核細胞轉(zhuǎn)錄后會切除，而大腸桿菌中不會被切除

。因此，基因工程中通常采用目的基因的cDNA形式；與細胞中的基因相比，cDNA不具有

啟動子和終止子（或非編碼區(qū)）

啟動子和終止子（或非編碼區(qū)）

等結(jié)構(gòu)，便于在原核細胞中表達出與真核細胞基因相同的蛋白質(zhì)。
（2）基因工程的核心步驟為

基因表達載體的構(gòu)建

基因表達載體的構(gòu)建

；圖示cDNA與質(zhì)粒的連接，需要先選擇

NsiⅠ和PstⅠ

NsiⅠ和PstⅠ

酶切cDNA和

SbfⅠ

SbfⅠ

酶切pXY6，酶切產(chǎn)物再通過

DNA連接酶

DNA連接酶

連接。
（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入提高大腸桿菌，常用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理，使其處于感受態(tài)。在選擇符合生產(chǎn)要求的重組質(zhì)粒過程中，在含萬古霉素的培養(yǎng)基中能生長的為導(dǎo)入

重組質(zhì)粒和pX6

重組質(zhì)粒和pX6

質(zhì)粒的大腸桿菌。
（4）若用限制酶BspEⅠ、PstⅠ和BclⅠ完全酶切符合生產(chǎn)要求的重組質(zhì)粒，可得到

5

5

種DNA片段。