基因工程在農(nóng)牧業(yè)、食品業(yè)和醫(yī)藥等方面展示出廣闊應(yīng)用前景
(1)構(gòu)建小鼠乳腺生物反應(yīng)器批量生產(chǎn)人胰島素,通過
逆轉(zhuǎn)錄
逆轉(zhuǎn)錄
獲得cDNA,再PCR后獲得人胰島素基因。在PCR過程中溫度先上升到90℃以上,后降低到50℃其目的分別是 高溫使模板雙鏈DNA解旋為單鏈
高溫使模板雙鏈DNA解旋為單鏈
、促進(jìn)引物與單鏈DNA相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合
促進(jìn)引物與單鏈DNA相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合
。一條單鏈cDNA在PCR儀中進(jìn)行n次循環(huán),需要消耗 2n-1
2n-1
個引物。構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入的受體細(xì)胞是 受精卵
受精卵
。
(2)若受體細(xì)胞是大腸桿菌,常用Ca2+處理大腸桿菌,使其處于感受態(tài),有利于 吸收周圍環(huán)境中的DNA
吸收周圍環(huán)境中的DNA
。理論上用大腸桿菌作為“工程菌株”制備的胰島素缺乏生物活性,從細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的角度分析,原因是 大腸桿菌是原核生物,沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體,無法對蛋白質(zhì)加工分泌到細(xì)胞外
大腸桿菌是原核生物,沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體,無法對蛋白質(zhì)加工分泌到細(xì)胞外
。
(3)人肺特異性x蛋白(LUNX)基因是某種肺癌診斷的標(biāo)志物。為研究LUNX基因的增強(qiáng)子是否具有增強(qiáng)基因表達(dá)的功能,及其發(fā)揮作用的位置是位于啟動子的上游還是下游??蒲腥藛T利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了3種LUNX基因增強(qiáng)子片段(用E1~E3表示)分別定向連接到pGL3載體中熒光素酶報(bào)告基因(luc+)、SV40啟動子的上游和下游,如圖1和圖2所示。通過相關(guān)技術(shù)檢測熒光素酶的活性,從而對增強(qiáng)子的功能進(jìn)行判斷,luc+的表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng),熒光素酶的活性越高。
①以上LUNX基因增強(qiáng)子片段經(jīng)回收純化測序正確后,將雙酶切后的PCR產(chǎn)物分別定向連接到用 KpnI和XhoI
KpnI和XhoI
雙酶切和 BamHI和SalI
BamHI和SalI
雙酶切的pGL3載體中,構(gòu)建LUNX基因增強(qiáng)子分別位于報(bào)告基因上游和下游的載體。
②利用相關(guān)技術(shù)對熒光素酶的活性進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖3,能得出結(jié)論 增強(qiáng)子E1、E2、E3在下游都能增強(qiáng)表達(dá),其中E1效果最為顯著。E3在啟動子的上游下游都能增強(qiáng)表達(dá)
增強(qiáng)子E1、E2、E3在下游都能增強(qiáng)表達(dá),其中E1效果最為顯著。E3在啟動子的上游下游都能增強(qiáng)表達(dá)
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