大豆凝集素(L)具有防御病害的功能,該蛋白存在于大豆種子的子葉中。研究人員嘗試?yán)玫鞍譒的特性構(gòu)建抗病毒馬鈴薯,進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
(1)從大豆抗病品種中獲取L基因,通過PCR的方法在基因兩側(cè)引入限制酶酶切位點(diǎn),根據(jù)圖1中T-DNA的結(jié)構(gòu),引入適宜的酶切位點(diǎn)是
XbaⅠ和SmaⅠ
XbaⅠ和SmaⅠ
。通過 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
法將酶切、連接產(chǎn)物導(dǎo)入馬鈴薯細(xì)胞,獲得多株轉(zhuǎn)基因抗病馬鈴薯。
(2)為研究轉(zhuǎn)基因馬鈴薯抗病毒植株的分子機(jī)理,研究人員利用Taqman探針和反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯多種防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè):
①提取抗病植株葉片細(xì)胞的 總mRNA
總mRNA
進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲取cDNA.
②設(shè)計(jì)各種防衛(wèi)基因的引物,利用圖2所示的原理進(jìn)行PCR。Taqman探針的結(jié)構(gòu)如圖所示,由于 探針有可以堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段
探針有可以堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段
,游離探針上的熒光素會(huì)與淬滅劑結(jié)合無法發(fā)出熒光。在PCR過程中,Taq酶體現(xiàn)出 5'→3'聚合酶與5'→3'外切酶
5'→3'聚合酶與5'→3'外切酶
兩種酶活性,在相同擴(kuò)增時(shí)間中,總熒光值與 待測(cè)基因的mRNA(轉(zhuǎn)錄)量
待測(cè)基因的mRNA(轉(zhuǎn)錄)量
成正比。
③經(jīng)檢測(cè),轉(zhuǎn)基因馬鈴薯水楊酸(SA)信號(hào)通路相關(guān)蛋白基因表達(dá)量顯著上升,SA是一種植物抗病有關(guān)的調(diào)節(jié)物質(zhì)。研究人員推測(cè)L儀器檢測(cè)通過激活SA途徑提升抗病能力,欲驗(yàn)證這一假設(shè),需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是 敲除SA受體基因或抑制SA信號(hào)途徑,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗病情況
敲除SA受體基因或抑制SA信號(hào)途徑,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗病情況
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