1．1965年中國科學家人工合成了具有生物活性的結晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質的桂冠，如圖是利用基因工程生產人胰島素過程中使用的質粒及目的基因的部分結構。請回答下列問題。
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（1）質粒上ori序列的堿基特點是 比值較高，圖示胰島素基因的轉錄以 鏈作為模板。
（2）在設計PCR引物時最好在引物的 端添加限制酶 的識別序列，PCR反應體系中引物的延伸需要TaqDNA聚合酶，此酶需要 （離子）的激活。
（3）生產過程中目的基因是利用胰島B細胞中的mRNA反轉錄得到的胰島素基因，不直接使用細胞中酶切獲得的的胰島素基因原因是 。
（4）科學家運用大引物PCR定點突變技術對胰島素第28位氨基酸實現(xiàn)了替換，獲得了速效胰島素類似物產品。相關原理如圖所示。

①第一次PCR至少需要 個循環(huán)才能獲得相應的大引物模板，第二次PCR應選用大引物兩條鏈中的 （填“A”或“B”），若第二次PCR計劃循環(huán)n次，至少需要大引物 個。
②β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產生藍色物質使菌落呈現(xiàn)藍色，否則菌落為白色。將轉化后的大腸桿菌接種到添加了 的培養(yǎng)基上，若觀察到菌落呈現(xiàn)白色，則表明 。

2．種子大小是作物重要的產量性狀。研究者對野生型擬南芥（2n=10）進行誘變篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個堿基G到A的替換，突變后的基因為隱性基因，據(jù)此推測突變體的表型與其有關，開展相關實驗?；卮鹣铝袉栴}：
（1）擬采用農桿菌轉化法將野生型DAI基因轉入突變體植株，用PCR反應擴增DAI基因，用限制性內切核酸酶對PCR產物和 進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達，其上下游序列需具備 。
（2）轉化后，T-DNA（其內部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換）可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單端一位點插入的植株，并進一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（如圖），用于后續(xù)驗證突變基因與表型的關系。

①農桿菌轉化T₀代植株并自交，將T₁代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了 。
②T₁代陽性植株自交所得的T₂代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約 %的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。
③將②中選出的T₂代陽性植株 （填“自交”、“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T₃代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達到 %的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標轉基因植株。

3．RNA沉默是雙鏈RNA被特異性的核酸酶降解，產生小干擾RNA（siRNA），這些siRNA與同源的靶RNA互補結合，特異降解靶RNA，從而抑制基因表達。棉蚜是棉花的主要害蟲，嚴重危害棉花的生產。E基因是棉蚜生長發(fā)育的重要基因，為了控制棉蚜對棉花的危害，科研人員通過轉基因技術，在棉花中表達棉蚜E基因的雙鏈RNA（dsRNA），特異性抑制棉蚜內源E基因的表達。如圖是主要流程，請回答：

限制酶	識別序列和切點
EcoRⅠ	G↓AATTC
KpnⅠ	G↓GTACC
BamHⅠ	G↓GATCC
XbaⅠ	T↓CTAGA

（1）根據(jù)PCR1反應體系中加入的引物1和2推測PCR2中加入的引物為 。
A．5'-AAATCTAGAAGCGACTCAAGATCATGGAGTAT-3'
B．5'-AAATCTAGACTGCCACTTCTTCAACTAATTCT-3'
C．5'-AAAGGATCCAGCGACTCAAGATCATGGAGTAT-3'
D．5'-AAAGGATCCCTGCCACTTCTTCAACTAATTCT-3'
（2）從理論上推測，PCR1第五輪循環(huán)產物中含有引物1的DNA片段所占的比例為 。圖中正義序列和反義序列中堿基排列順序 （填“大多數(shù)相同”或“大多數(shù)不同”或“相同”或“不同”）。過程①需要的工具酶除限制酶外還需要 。
（3）過程②將表達載體轉化到經 處理的農桿菌菌株后，為了確定重組質粒已經成功轉化可以通過 驗證。
（4）過程④愈傷組織形成棉花植株的過程稱為 。轉基因棉花再生植株移栽到溫室后，葉片涂抹 檢測抗性，并提取DNA進行PCR分析。
（5）科研人員采用特定的方法大量提取成功轉化的4株棉花植株葉片的基因組DNA，用HindⅢ完全消化，消化產物經電泳、轉膜后與目的基因的探針雜交，其雜交帶結果如圖2所示（圖中數(shù)字2～5代表轉化成功的植株，數(shù)字1代表對照組）。下列有關分析正確的有 。
①對照組可以用非轉基因棉花的基因組DNA進行實驗
②數(shù)字3所代表的植株中目的基因插入染色中的兩個不同位置
③選擇HindⅢ進行消化的原因是基因組DNA中一般只有1～2切點
④相同位置上雜交帶對應DNA片段的脫氧核苷酸序列相同
（6）科研人員進一步鑒定上述4號泳道對應的植株，確定獲得一株轉基因抗性植株CZ4，CZ4連續(xù)自交兩代，則F₂中抗性植株占比為 。