研究發(fā)現(xiàn)，通過位點特異性重組系統(tǒng)刪除目的基因和標(biāo)記基因策略成為目前解決轉(zhuǎn)基因植物生物安全性問題的一條理想途徑。Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)由重組酶Cre 和LoxP位點組成，LoxP位點包含兩個識別序列和8bp的切割序列，DNA的切割和連接發(fā)生在8bp的切割序列，如圖1所示，Loxp序列對啟動子的功能無影響。當(dāng)DNA分子中含兩個同向 LoxP位點時，重組酶將刪除兩LoxP間的全部序列且只殘留下一個LoxP位點。為將轉(zhuǎn)基因水稻食用部位胚乳中標(biāo)記基因和外源基因定點刪除，研究人員利用水稻胚乳特異性啟動子Gtl控制重組酶Cre 基因的表達，以組成型啟動子Acin 控制的紅色熒光蛋白基因DsRed₂作為報告基因，以組成型啟動子P³⁵S 驅(qū)動的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt 作為選擇標(biāo)記基因，構(gòu)建的兩種基因表達載體的T一DNA 即為位點特異性重組系統(tǒng)，如圖2 和圖3所示。P₁、P₂和P₃為引物，LB和RB為T-DNA邊界序列，組成型啟動子可以啟動基因在所有組織中表達。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻幼胚愈傷組織，得到再生苗后移栽大田?；卮鹣铝袉栴}：

（1）通過農(nóng)桿菌將基因表達載體導(dǎo)入水稻的原理

農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上

農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上

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（2）為了確定得到的水稻是否為轉(zhuǎn)基因植株，可選取適齡轉(zhuǎn)基因水稻的葉片浸泡在含有

潮霉素

潮霉素

的溶液中，分析其是否具有抗性；可選用圖中引物

P1和P2

P1和P2

進行 PCR擴增并通過電泳得到的相應(yīng)條帶來驗證路線一轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中能夠特異性刪除相關(guān)基因；兩種刪除路線相比，能夠在胚乳中檢測到紅色熒光而在其他器官中檢測不到紅色熒光的是

路線二

路線二

（填“路線一“或“路線二“），原因是

胚乳中當(dāng)重組酶Cre把兩loxP位點之間的序列刪除后，Acti啟動子可驅(qū)動DsRed2基因表達，因而在胚乳中能檢測到紅色熒光，而在其他器官中啟動子Gt1和重組酶Cre基因位于兩loxP位點之間，并插入到Actin啟動子和DsRed2基因之間，隨斷了DsRed2基因的表達，檢測不到紅色熒光

胚乳中當(dāng)重組酶Cre把兩loxP位點之間的序列刪除后，Acti啟動子可驅(qū)動DsRed2基因表達，因而在胚乳中能檢測到紅色熒光，而在其他器官中啟動子Gt1和重組酶Cre基因位于兩loxP位點之間，并插入到Actin啟動子和DsRed2基因之間，隨斷了DsRed2基因的表達，檢測不到紅色熒光

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（3）食用大米是去除了胚和種皮剩下的胚乳結(jié)構(gòu)。只將轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳中特定的外源基因特異性刪除而胚中保留的好處是

轉(zhuǎn)基因水稻種子的胚乳中發(fā)生了外源基因的特異性除，獲得安全食用的轉(zhuǎn)基因精米；同時其完整的種子保留了所有的外源基因，能保證其后代仍具有轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良性狀

轉(zhuǎn)基因水稻種子的胚乳中發(fā)生了外源基因的特異性除，獲得安全食用的轉(zhuǎn)基因精米；同時其完整的種子保留了所有的外源基因，能保證其后代仍具有轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良性狀

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