PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因,研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因),利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?;卮鹣铝袉栴}:
(1)為獲取phb2基因,提取該動物肝臟組織的
總RNA
總RNA
,再經(jīng) 逆轉(zhuǎn)錄
逆轉(zhuǎn)錄
過程得到cDNA,將其作為PCR反應(yīng)的模板,并設(shè)計一對特異性引物來擴(kuò)增目的基因。與生物體內(nèi)的DNA聚合酶相比,PCR技術(shù)中所用的DNA聚合酶特點是 耐高溫
耐高溫
。
(2)圖1為所用載體圖譜示意圖,質(zhì)粒DNA含有啟動子,啟動子是 RNA聚合酶
RNA聚合酶
識別并結(jié)合的位點。質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點,可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能 準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)制
準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)制
。
名稱 |
識別序列及切割位點 |
名稱 |
識別序列及切割位點 |
HindⅢ |
A↓AGCTT |
EcoRⅠ |
G↓AATTC |
PvitⅡ |
CAG↓CTG |
PstⅠ |
CTGC↓AG |
KpnⅠ |
G↓GTACC |
BamHⅠ |
G↓GATCC |
注:箭頭表示切割位點
(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶,其中,DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是
磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
。圖1中限制酶的識別序列及切割位點見圖2,為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接,在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入
EcoRⅠ
EcoRⅠ
和
PvitⅡ
PvitⅡ
兩種不同限制酶的識別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時,可選用
T4DNA連接酶
T4DNA連接酶
(填“E?coliDNA連接酶”或“T
4DNA連接酶”)。
(4)轉(zhuǎn)化前需用
Ca2+
Ca2+
處理大腸桿菌細(xì)胞,使其處于
感受態(tài)
感受態(tài)
,以提高轉(zhuǎn)化效率。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含
氨芐青霉素
氨芐青霉素
的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。