單寧酶可水解單寧酸為沒食子酸,降低茶湯中單寧酸含量,解決茶飲料“冷后渾”問題和果汁類飲料除澀問題。我國科學(xué)家在土壤中篩選出分泌單寧酶的黑曲霉Lys117,利用基因工程對其進(jìn)行改造,提取單寧酶基因與強(qiáng)表達(dá)組件(強(qiáng)表達(dá)啟動子和信號肽)結(jié)合,最終實(shí)現(xiàn)單寧酶的高產(chǎn)。回答下列問題:
(1)黑曲霉Lys117的分離篩選:將土樣稀釋適量倍數(shù)后,采用涂布平板法接種于含有溴酚藍(lán)(溴酚藍(lán)在單寧酸環(huán)境中為藍(lán)紫色,在沒食子酸環(huán)境中為黃色)的選擇培養(yǎng)基上。該選擇培養(yǎng)基按物理性質(zhì)分屬于
固體
固體
培養(yǎng)基。根據(jù)選擇培養(yǎng)基的 黃色圈直徑的大小
黃色圈直徑的大小
(填現(xiàn)象)作為挑取單寧酶產(chǎn)生菌的標(biāo)志。
(2)單寧酶基因擴(kuò)增及組裝如圖所示:P1左側(cè)有RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn),為實(shí)現(xiàn)單寧酶基因與強(qiáng)表達(dá)組件定向連接,PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物時(shí)需對引物添加相應(yīng)的限制酶識別序列。則PCR應(yīng)選擇的引物對為 P2與P3
P2與P3
,在各引物前添加的識別序列對應(yīng)的限制酶分別是 Bg1Ⅰ、EcoRⅠ
Bg1Ⅰ、EcoRⅠ
。
(3)與強(qiáng)表達(dá)組件結(jié)合后的基因與Ti質(zhì)粒重組,該過程為基因工程的核心步驟,即 基因表達(dá)載體的構(gòu)建
基因表達(dá)載體的構(gòu)建
。利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒作為載體的原理是 農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞,并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上
農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞,并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上
,與目的基因?qū)胫参锛?xì)胞類似。已知信號肽負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到不同的具膜細(xì)胞器內(nèi),本實(shí)驗(yàn)中信號肽存在的意義為 信號肽會引導(dǎo)肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繼續(xù)合成與加工
信號肽會引導(dǎo)肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繼續(xù)合成與加工
。
(4)重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入目的菌并檢測:將重組Ti質(zhì)粒用特定方法導(dǎo)入黑霉菌Lys117,記為Lys117+,可依據(jù) Lys117+中單寧酶表達(dá)量的高低
Lys117+中單寧酶表達(dá)量的高低
,最終鑒定出高產(chǎn)單寧酶的黑霉菌。