TGFβ信號(hào)通路可通過S蛋白去磷酸化抑制癌細(xì)胞增殖，與該過程有關(guān)的N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白發(fā)生磷酸化。藥物SPD可通過影響R蛋白來增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TGF-β信號(hào)通路的響應(yīng)。為探索藥物SPD治療癌癥的機(jī)理，科研人員通過構(gòu)建基因表達(dá)載體來獲得融合蛋白S-HA、N-HA和R-HA。HA是一種短肽，連接在S、N或R蛋白的羧基端（不影響S、N或R的功能），細(xì)胞中只有帶HA標(biāo)簽的融合蛋白能與介質(zhì)上的HA抗體結(jié)合，從而分離得到HA標(biāo)簽融合蛋白。構(gòu)建融合蛋白S-HA基因表達(dá)載體的模式圖如圖1（注：雙鏈DNA的一條鏈?zhǔn)蔷幋a鏈，另一條鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄的模板鏈）。請(qǐng)回答下列問題：

（1）啟動(dòng)子是

RNA聚合

RNA聚合

酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)；組成HA的基本單位是

氨基酸

氨基酸

。
（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增S基因并保證其兩端存在限制酶NheⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列時(shí)，需添加的一對(duì)引物是

①③

①③

（選填下面的數(shù)字序號(hào)）。在反應(yīng)體系中添加的dNTP的作用是提供

原料

原料

和

能量

能量

。
①5'GCTAGCATGGAC3'
②5'CAGGTACGATCG3'
③5'AAGCTTCCATGGCC3'
④5'AAGCTTTCAGTCTA3'
（3）將擴(kuò)增后的S基因插入載體上，構(gòu)建圖1所示的S-HA融合基因表達(dá)載體。將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌前，先用Ca²⁺處理大腸桿菌的目的是使其成為

感受態(tài)細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞

。篩選出符合要求的受體菌后，經(jīng)適宜條件培養(yǎng)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)有S蛋白的氨基酸序列但沒有HA的氨基酸序列，據(jù)圖1分析，出現(xiàn)該問題的原因是S基因編碼

終止密碼子

終止密碼子

未刪除，導(dǎo)致融合基因翻譯提前終止，未表達(dá)出HA的氨基酸序列。
（4）融合蛋白表達(dá)成功并分離得到R-HA和磷酸化的S-HA、N-HA。將三種融合蛋白按照如表所示的組合方式分別在緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)S-HA和N-HA的磷酸化水平。據(jù)檢測(cè)結(jié)果推測(cè)R蛋白的作用是對(duì)S蛋白和N蛋白

去磷酸化有促進(jìn)作用

去磷酸化有促進(jìn)作用

。

分組		①	②	③	④
組合方式	R-HA	-	+	-	+
	P-S-HA	+	+	-	-
	P-N-HA	-	-	+	+
檢測(cè)結(jié)果	P-S-HA
	P-N-HA

“+”表示有；“-”表示無；“P”表示融合蛋白的磷酸化
（5）向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度SPD，處理相同時(shí)間，通過電泳檢測(cè)細(xì)胞中R蛋白水平，結(jié)果如圖2所示。綜合以上研究結(jié)果推測(cè)，藥物SPD治療癌癥的機(jī)理可能是：SPD通過促進(jìn)

R蛋白表達(dá)或者促進(jìn)R蛋白表達(dá)對(duì)S蛋白去磷酸化

R蛋白表達(dá)或者促進(jìn)R蛋白表達(dá)對(duì)S蛋白去磷酸化

，直接或間接降低

S蛋白的磷酸化水平

S蛋白的磷酸化水平

水平，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。