（四）基因敲除與斑馬魚
CRISPR/Cas9系統(tǒng)由單鏈的向?qū)NA（gRNA）和核酸內(nèi)切酶Cas9構(gòu)成，可以定向切割DNA敲除基因，最早在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，目前被廣泛用于哺乳動(dòng)物的基因編輯。科研人員為高效獲得特定基因敲除的斑馬魚系，對(duì)Cas9基因序列進(jìn)行了優(yōu)化改造的研究。
（1）CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，組成gRNA和Cas9蛋白的基本單位分別是

核糖核苷酸和氨基酸

核糖核苷酸和氨基酸

。
（2）研究人員發(fā)現(xiàn)，不同物種的細(xì)胞會(huì)“偏愛“使用一種密碼子決定特定的氨基酸。為了讓細(xì)菌的Cas9基因序列在斑馬魚中更好的表達(dá)，需要對(duì)Cas9基因序列進(jìn)行優(yōu)化改造。以下說(shuō)法合理的是

ABD

ABD

。（多選）
A.大多數(shù)氨基酸對(duì)應(yīng)不止一個(gè)密碼子是優(yōu)化改造的重要依據(jù)
B.基因組序列分析可以推測(cè)出不同物種的細(xì)胞對(duì)密碼子的偏好性
C.優(yōu)化改造前后Cas9基因轉(zhuǎn)錄出的Cas9mRNA不變
D.優(yōu)化改造前后Cas9基因表達(dá)的Cas9蛋白結(jié)構(gòu)不變
（3）研究人員發(fā)現(xiàn)，Cas9基因優(yōu)化改造后表達(dá)效率顯著提升，但產(chǎn)生的Cas9蛋白無(wú)法在斑馬魚中發(fā)揮作用。若在Cas9基因兩端添加編碼核定位短肽的DNA序列（NLS）即可解決問(wèn)題，如圖1，據(jù)此推測(cè)，NLS添加前后Cas9蛋白作用情況不同的原因是

NLS添加前，來(lái)自細(xì)菌的Cas9蛋白不能進(jìn)入斑馬魚（真核）細(xì)胞的細(xì)胞核，NLS添加后，可以表達(dá)產(chǎn)生核定位短肽，引導(dǎo)Cas9蛋白（通過(guò)斑馬魚細(xì)胞核的核孔）進(jìn)入斑馬魚細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)揮作用（定向切割DNA）

NLS添加前，來(lái)自細(xì)菌的Cas9蛋白不能進(jìn)入斑馬魚（真核）細(xì)胞的細(xì)胞核，NLS添加后，可以表達(dá)產(chǎn)生核定位短肽，引導(dǎo)Cas9蛋白（通過(guò)斑馬魚細(xì)胞核的核孔）進(jìn)入斑馬魚細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)揮作用（定向切割DNA）

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（4）gRNA能引導(dǎo)Cas9蛋白到DNA的特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割。研究人員用化學(xué)方法合成特定的gRNA，與Cas9mRNA一起注射到斑馬魚細(xì)胞，篩選出特定基因敲除的斑馬魚。下列敘述正確的是

B

B

。
A.兩種RNA通過(guò)顯微注射法導(dǎo)入斑馬魚的卵細(xì)胞
B.gRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)功能
C.Cas9mRNA能對(duì)基因位點(diǎn)進(jìn)行切割
D.基因敲除后的斑馬魚一定發(fā)育異常
研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了1種P2yl2基因敲除的斑馬魚突變體，發(fā)現(xiàn)其原始造血系
統(tǒng)受到了影響。經(jīng)測(cè)序，野生型和突變型在基因敲除部位的序列如圖2。

（5）根據(jù)圖2和所學(xué)知識(shí)，分析P2yl2基因敲除對(duì)斑馬魚原始造血系統(tǒng)產(chǎn)生影響的機(jī)制：

突變體的P2y12基因發(fā)生了堿基對(duì)的替換和堿基對(duì)的缺失，導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)（氨基酸種類、氨基酸數(shù)目、氨基酸序列、肽鏈長(zhǎng)度等）改變，從而失去正常功能，對(duì)斑馬魚的原始造血系統(tǒng)造成了影響

突變體的P2y12基因發(fā)生了堿基對(duì)的替換和堿基對(duì)的缺失，導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)（氨基酸種類、氨基酸數(shù)目、氨基酸序列、肽鏈長(zhǎng)度等）改變，從而失去正常功能，對(duì)斑馬魚的原始造血系統(tǒng)造成了影響

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